彭婕，居小倩，伍剛，甘金華,2*，何力,2*

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(武漢)，武漢 430223； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實驗室，北京 100141)

持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants，POPs)是一類結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，極易在生物體脂肪組織中累積的化學(xué)物質(zhì)，即使在低濃度下也極具毒性[1]。持久性有機(jī)污染物包括有機(jī)氯農(nóng)藥(organochlorine pesticide，OCPs)、多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyl，PCBs)以及多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)等。因曾在工業(yè)和農(nóng)業(yè)活動中使用而導(dǎo)致環(huán)境污染，在土壤、空氣、水和野生動物中經(jīng)常檢測到有機(jī)氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯殘留[2-4]。持續(xù)暴露于有機(jī)氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯中會直接危害人類健康，如可致癌或?qū)е律窠?jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常[5]。2004年斯德哥爾摩公約生效，旨在禁止或限制使用持久性有機(jī)污染物[6-7]。由于有機(jī)氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯具親脂性，其可以在水生動物中積累并造成負(fù)面影響[8]，因此近年來，水產(chǎn)品中有機(jī)氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯的痕量檢測方法研究受到了高度重視。目前，針對有機(jī)氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯等持久性有機(jī)污染物常用的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[9-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[12-15]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[16-20]。國內(nèi)外對于該兩種系列殘留物含量單獨(dú)測定的報道較多，偶有同時測定的報道[10,20]，但測定的殘留物種類范圍較窄。相較于其他方法，本研究中涵蓋的多氯聯(lián)苯和有機(jī)氯農(nóng)藥種類更全，同時針對水產(chǎn)品這類成分較為復(fù)雜的生物基質(zhì)樣品，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法有效排除假陽性的干擾[15-16,20]，檢出限更低，靈敏度進(jìn)一步得到提高。

本研究采用固相萃取凈化氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對稻田水產(chǎn)品中19種有機(jī)氯農(nóng)藥及7種指示性多氯聯(lián)苯進(jìn)行定性定量分析，建立了一種可靠、靈敏且可同時測定這兩類持久性有機(jī)污染物的檢測方法，可提高檢測效率，降低檢測成本，對于保障人類健康、保護(hù)環(huán)境及加強(qiáng)農(nóng)藥殘留的監(jiān)控具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與裝置

主要包括：TSQ9000氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電子轟擊(EI)電離源及TraceFinder分析軟件(美國賽默飛世爾公司)；Avanti JXN-26高速冷凍離心機(jī)(美國貝克曼公司)；PL-202電子天平(美國梅特勒-托利多公司)；MX-F固定渦旋混勻儀(美國賽洛捷克公司)；BUCHI R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；EFAA-AC-02氮吹儀(上海安譜實驗科技股份有限公司)；SK5210LHC超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 材料與試劑

主要包括：26種POPs標(biāo)準(zhǔn)溶液：α-六六六(α-HCH)、β-六六六(β-HCH)、γ-六六六(γ-HCH)、δ-六六六(δ-HCH)、o,p′-DDT、p,p′-DDT、p,p′-DDD、p,p′-DDE、六氯苯(hexachlorobenzene，HCB)、五氯硝基苯(Pentachloronitrobenzene，PCNB)、硫丹I(α-endosulfan)、硫丹II(β-endosulfan)、順式氯丹(cis-chlordane)、反式氯丹(trans-chlordane)、艾氏劑(aldrin)、狄氏劑(dieldrin)、異狄氏劑(endrin)、七氯(heptachlor)、環(huán)氧七氯(heptachlor epoxide)、PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB153、PCB138和PCB180，各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度均為100 mg/L，購自天津阿爾塔科技有限公司。正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙腈和異辛烷，均為色譜純，購自美國J.T.Baker公司。硅膠固相萃取柱、氨基固相萃取柱和弗羅里硅土固相萃取柱(填充質(zhì)量500 mg，固相萃取小柱體積3 mL)，購自上海安譜實驗科技股份有限公司。實驗用水為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

26種POPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：用異辛烷配制各單體農(nóng)藥質(zhì)量濃度均為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用異辛烷配制成1、5、10、50、100和500 μg/L等一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 實驗條件

1.4.1 樣品制備

選取產(chǎn)量較高的克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)和鯉(Cyprinuscarpio)作為稻田水產(chǎn)品的代表，從稻田水產(chǎn)品養(yǎng)殖基地采集鯉和克氏原螯蝦樣品。鯉去鱗，帶皮沿背脊取肌肉部分，均質(zhì)混勻；克氏原螯蝦去頭、殼和腸腺，取肌肉部分，均質(zhì)混勻；分別裝入聚乙烯瓶中，于-18 ℃冷凍保存，測定前解凍，稱樣。

1.4.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g鯉或克氏原螯蝦樣品于50 mL具塞離心管中，加入15 mL二氯甲烷-正己烷(1∶1，V/V)混合溶液，渦旋混勻1 min，超聲5 min，5 000 r/min冷凍離心5 min，取出上清液。按上述方法重復(fù)操作1次，合并2次上清液，于35 ℃水浴減壓蒸發(fā)至近干，用4 mL正己烷分2次溶解殘渣，得到待凈化液。

取5 mL正己烷活化氨基固相萃取柱，再加入待凈化液，收集流出液，最后加入5 mL正己烷-丙酮(9∶1，V/V)混合液洗脫，合并收集洗脫液，40 ℃水浴氮?dú)獯抵两?，? mL異辛烷復(fù)溶，待GC-MS/MS分析。

1.4.3 色譜條件

Thermo TG-5MS色譜柱(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度290 ℃；升溫程序：80 ℃保持1 min，以30 ℃/min升至170 ℃，以5 ℃/min升至240 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至300 ℃，保持3 min；不分流進(jìn)樣；載氣(He)流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。

1.4.4 質(zhì)譜條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲8 min；采集方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(selective reaction monitoring，SRM)模式；定量方式為峰面積外標(biāo)法定量。26種持久性有機(jī)污染物的保留時間、定量離子、定性離子以及碰撞能量見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件優(yōu)化

對1.3中最高濃度的26種POPs混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全掃描，確定26種目標(biāo)物的母離子，再分別對每種母離子進(jìn)行掃描，優(yōu)化碰撞能量，確定定量和定性子離子，最后根據(jù)26種目標(biāo)物保留時間、母離子、子離子的質(zhì)荷比和碰撞能量等參數(shù)構(gòu)建SRM測定方法。

2.2 提取溶劑的選擇

有機(jī)氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯的提取溶劑主要有乙腈[11]、正己烷-丙酮混合溶液[16]和二氯甲烷-正己烷混合溶液[9-10]等。實驗以空白鯉為基質(zhì)，分析比較了乙腈、正己烷-丙酮(1∶1，V/V)和二氯甲烷-正己烷(1∶1，V/V)等3種提取溶劑對鯉中26種目標(biāo)物的提取效率(圖1)。結(jié)果表明，乙腈作為提取溶劑時，能將水產(chǎn)品中的水分一并提取出來，導(dǎo)致樣品濃縮時不容易蒸干，進(jìn)而影響實驗結(jié)果；采用正己烷-丙酮(1∶1，V/V)提取目標(biāo)物時，丙酮和水互溶，會將樣品中的水溶性蛋白提取出來，提取液中雜質(zhì)較多，使得平行樣之間偏差較大；采用二氯甲烷-正己烷(1∶1，V/V)作為提取溶劑時，26種目標(biāo)物回收率穩(wěn)定，均能達(dá)70%～110%，因此選擇該溶液作為最佳提取溶劑。

2.3 濃縮和凈化方式的選擇

除了提取效率，26種POPs的回收率還取決于濃縮和凈化兩個步驟。濃縮方法主要為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和氮吹濃縮，經(jīng)試驗比較，發(fā)現(xiàn)兩種濃縮方式下的加標(biāo)回收率結(jié)果相差不大，考慮到前者濃縮速度快，因此本文選擇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。有機(jī)氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯測定常用的凈化方式為固相萃取凈化和濃硫酸凈化，傳統(tǒng)的濃硫酸凈化去除脂類物質(zhì)和色素等雜質(zhì)效果顯著，但其對硫丹、狄氏劑、異狄氏劑和艾氏劑等目標(biāo)物的加標(biāo)回收率影響較大，可能是由于濃硫酸的強(qiáng)氧化性導(dǎo)致上述物質(zhì)回收率明顯偏低。根據(jù)已有報道[16-18,20]，用于有機(jī)氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯的凈化小柱主要包括弗羅里硅土固相萃取柱(Florisil)、硅膠固相萃取柱(Si)和氨基固相萃取柱(NH2)。3種固相萃取柱對回收率的影響如圖2所示。由圖2可知，采用硅膠固相萃取柱凈化時，硫丹I 和反式氯丹損失較大，回收率低于70%；使用弗羅里硅土固相萃取柱時，目標(biāo)物回收率較好，但存在背景干擾，平行樣之間結(jié)果差異明顯；使用氨基固相萃取柱時，基質(zhì)凈化效果好，雜質(zhì)干擾小，得到的色譜圖峰型較好，所有目標(biāo)物的加標(biāo)回收率均分布在78.0%～106.0%之間，可見其凈化效果是3種固相萃取柱中最好的，因此選擇氨基固相萃取柱作為稻田水產(chǎn)品中26種POPs的最佳凈化方式。

2.4 線性范圍與靈敏度

在優(yōu)化條件下，對1.3中配制的系列混合工作溶液進(jìn)行測定，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到26種POPs的線性方程。26種POPs在1～500 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.997。在鯉和克氏原螯蝦空白樣品中添加一定含量的26種POPs標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過提取凈化后上機(jī)測定，以不小于3倍信噪比(S/N≥3)確定方法的檢測限(LOD)為0.20～1.00 μg/kg，以不小于10倍信噪比(S/N≥10)確定方法的定量限(LQD)為0.60～3.00 μg/kg(表2)。本方法不僅檢測參數(shù)范圍更廣，同時方法檢出限優(yōu)于其他相關(guān)文獻(xiàn)報道值，可保證稻田水產(chǎn)品中26種POPs殘留的定性與定量檢測。

表2 26種持久性有機(jī)污染物的線性關(guān)系、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測限與定量限Tab.2 Regression equations, linear ranges, correlation coefficients,limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LQDs) for the 26 POPs

2.5 方法的精密度與回收率

以稻田養(yǎng)殖鯉和克氏原螯蝦空白樣品為測試對象，進(jìn)行低、中和高不同濃度水平的添加回收實驗，按實驗方法平行測定7次，26種POPs在鯉和克氏原螯蝦中的平均添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。由表3可知，26種POPs在鯉中不同加標(biāo)水平下的平均回收率為73.6%～115.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.29%～10.80%；在克氏原螯蝦中的平均回收率為70.6%～106.0%，RSD為3.58%～10.90%，此方法具有較高的回收率和良好的精密度，能夠滿足稻田水產(chǎn)品中26種POPs殘留檢測的要求。

表3 26種持久性有機(jī)污染物在鯉和克氏原螯蝦中的回收率及精密度Tab.3 Recoveries and RSDs of 26 POPs in Cyprinus carpio and Procambarus clarkii n=7

續(xù)表3，Tab.3 Continued

續(xù)表3，Tab.3 Continued

2.6 實際樣品測定

采用本研究建立的方法對湖南、湖北采集的50例稻田養(yǎng)殖水產(chǎn)品(30例克氏原螯蝦和20例稻花鯉)進(jìn)行檢測，所有樣品中7種指示性多氯聯(lián)苯均未檢出，有機(jī)氯農(nóng)藥僅六氯苯、p,p′-DDE和p,p′-DDD有一定濃度的檢出，檢出率分別為20.1%、86.7%和11.2%，含量范圍分別為六氯苯：ND～5.35 μg/kg；p,p′-DDE：ND～6.03 μg/kg；p,p′-DDD：ND～6.89 μg/kg，上述檢出范圍均遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)最大殘留限量要求的500 μg/kg[21]。因此，本次監(jiān)測的稻田養(yǎng)殖水產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量不會對消費(fèi)者健康構(gòu)成顯著風(fēng)險。陽性鯉樣品、陽性克氏原螯蝦樣品及26種持久性有機(jī)污染物標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品(10 μg/L)總離子流圖見圖3。

3 結(jié)論

本研究采用固相萃取法對樣品凈化，建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定稻田水產(chǎn)品中26種持久性有機(jī)污染物的方法。水產(chǎn)品中目標(biāo)物的檢測限為0.20～1.00 μg/kg、定量限為0.60～3.00 μg/kg，平均添加回收率均在70.0%～120.0%之間。本方法操作簡便，靈敏度高，回收率和穩(wěn)定性均能滿足檢測要求，對于水產(chǎn)品中有機(jī)氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯同時快速測定有借鑒作用。