初文琴，劉振，劉昕，毛相朝,2*

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266000； 2.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266000)

殼聚糖酶具有巨大的工業(yè)應用價值，主要用于酶解殼聚糖制備殼寡糖，殼寡糖與殼聚糖相比，具有較高的生理活性，如抗菌、抗氧化、抗腫瘤及降血壓等[1-2]。殼寡糖制備方法主要有物理化學法和酶法，與物理化學法相比，酶法制備具有反應條件溫和、特異性強、無副產物、綠色環(huán)保和易控制等優(yōu)點[3]。因此，酶法(殼聚糖酶)制備殼寡糖已成為當前研究的熱點。

殼聚糖酶主要通過野生菌株和構建基因工程菌株的方法制備。目前已從自然界中分離純化出多株可產生殼聚糖酶的野生菌株，如Zitouni等[4]從Paenibacillussp. 1794中分離純化了一種耐熱殼聚糖酶Csn1794，純化后的比酶活可達122 U/mg；方祥年等[5]從球孢白僵菌Beauveriabassiana1316-V1中分離純化得到的殼聚糖酶的酶活可達45 U/mg。但是野生菌的殼聚糖酶產量較低，無法實現(xiàn)工業(yè)化生產，因此，很多研究者致力于對不同來源的殼聚糖酶進行異源高效表達，如分離于Bacillussp. TS的殼聚糖酶成功在大腸桿菌中表達，酶活可達186 U/mL[6]；分離于B.subtilisHD145的殼聚糖酶在Pichiapastoris中實現(xiàn)胞外表達，酶活可達9 000 U/mg[7]；分離于B.subtilis168的殼聚糖酶在B.subtilisPT5中成功表達，且在信號肽aprE介導下，使胞外酶活達到(156.00±4.68) U/mL[8]。

本研究表達的殼聚糖酶OUC-Csn21c已在大腸桿菌(Escherichiacoli)中成功表達(粗酶活可達100.4 U/mg)，該酶屬于糖苷水解酶GH-46家族，是一種外切酶，其酶解產物為D-氨基葡萄糖和殼二糖，可用于工業(yè)生產氨基葡萄糖和殼寡糖[9]。本研究選擇的宿主為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，相較于大腸桿菌，枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)具有一些自身優(yōu)勢[10]：1)安全無毒，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)將其評為生物安全(generally regarded as safe，GRAS)菌株；2)具有較高的同源蛋白質和異源蛋白質分泌能力。

為進一步提高殼聚糖酶OUC-Csn21c在枯草芽孢桿菌中的胞外表達量，本研究探究了2種分子伴侶對其胞外表達量的影響。其中分子伴侶是介導其他多肽正確組裝的一類蛋白質家族，但本身并不是蛋白質最終結構的組成部分[11]，其功能是確保蛋白質的正確組裝。本研究選擇PrsA和CsaA 2種分子伴侶是，因其來源于枯草芽孢桿菌，且有研究證明二者可提高胞外蛋白的分泌量。研究發(fā)現(xiàn)，PrsA作用于細胞膜與細胞壁之間的蛋白[12-13]。楊何寶等[14]通過整合分子伴侶PrsA使得蛋白酶的活性提高了23%；陳景奇[15]通過整合分子伴侶PrsA使淀粉酶AmyLM2和AmyS的酶活分別提高了3.2倍和5.5倍。CsaA通過提高分泌前蛋白的轉位能力，使其更容易被突變SecA蛋白識別并作用，或者是通過刺激提高SecA蛋白的轉位活性來實現(xiàn)外源蛋白的胞外分泌[16]。蔣紅亮等[17]通過整合分子伴侶CsaA使青霉素?；傅拿富盍μ岣?6%。

本文選擇枯草芽孢桿菌作為表達宿主，成功實現(xiàn)了殼聚糖酶OUC-Csn21c的胞外表達，并在此基礎上探究了2種分子伴侶(PrsA和CsaA)對其胞外表達量的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑材料

1.1.1 菌株及質粒

本文所用菌株及質粒如表1所示。

表1 本研究所用菌株及質粒Tab.1 Strains and plasmids used in this research.

1.1.2 實驗試劑及儀器設備

本研究所用到的P505-d1聚合酶(PhantaTMMax Super-Fidelity DNA polymerase)和Taq聚合酶混合體系(2×Taq Master Mix)均購自南京諾唯贊生物科技有限公司(Vazyme)?？焖儋|粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司(TIANGEN)。膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司。PCR引物由青島生工生物科技有限公司合成。

本文所用培養(yǎng)基制備過程分別為：

1)LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化鈉，5 g/L酵母提取物，固體LB培養(yǎng)基中添加1.5%～2.0%的瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min后備用。

2)復蘇培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，山梨醇91 g/L，甘露醇69 g/L，115 ℃滅菌30 min后備用。

3)電轉培養(yǎng)基：山梨醇91 g/L，甘露醇91 g/L，葡萄糖100 g/L，115 ℃滅菌30 min后備用。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增與純化

殼聚糖酶OUC-Csn21c基因來源于鏈霉菌StreptomycesalbolongusATCC 27414，啟動子Pshuttle09[18]由青島生工生物合成，分子伴侶PrsA和CsaA基因均來自于B.subtilisWB800基因組。以上所有片段均通過PCR方法制備，片段Pshuttle09-prsA和Pshuttle09-csaA則是以融合PCR的方式分別通過引物43-09-F和prsA-R、csaA-R獲得。

將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。使用膠回收試劑盒對擴增產物進行切膠回收。

1.2.2 目的片段與載體的連接

用無縫拼接試劑盒將ouc-csn21c整合到pP43NMK質粒上，形成質粒pP43NMK-Csn21c。然后，分別將Pshuttle09-prsA和Pshuttle09-csaA片段整合到pP43NMK-Csn21c上得到pP43NMK-Csn21c-PrsA和pP43NMK-Csn21c-CsaA。連接后的產物，通過化學法轉化入E.coliDH5α并進行陽性克隆驗證以及序列鑒定。

1.2.3 陽性克隆驗證與質粒提取

用無菌牙簽挑取平板上單菌落至含10 μL無菌水的1.5 mL離心管中混勻，然后吸取2 μL至PCR小管中，使用2×Taq Master Mix進行PCR驗證，PCR驗證體系為：2 μL模板DNA，6.25 μL 2×Taq Master Mix，3.25 μL無菌水，1μL DMSO。驗證條帶正確，則向剩余8 μL菌液的1.5 mL離心管內加入800 μL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃ 200 rpm培養(yǎng)4～6 h后送至青島生工公司進行序列測定。序列測定正確的用質粒提取試劑盒提取質粒。

表2 實驗所用引物序列Tab.2 Primer sequence used in this research.

1.2.4 枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800感受態(tài)的制備及轉化

接種環(huán)蘸取凍存的B.subtilisWB800在無抗的LB固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于10 mL無抗LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 200 rpm培養(yǎng)過夜，取3 mL培養(yǎng)物接種至40 mL 含0.5 mol/L山梨醇的LB培養(yǎng)基，37 ℃ 200 rpm培養(yǎng)至菌液濃度OD600達到0.85～0.95之間。然后，將菌液冰浴10 min，4 ℃ 5 000 rpm離心5 min，收集菌體沉淀。用預冷的電轉培養(yǎng)基15～20 mL重懸菌體，4 ℃ 5 000 rpm離心5 min，如此重復3次。然后，用電轉培養(yǎng)基1.0 mL重懸菌體，每管分裝100 μL。

取1 μg左右重組質粒加入到100 μL感受態(tài)細胞中，1.8 kV電擊1次，然后迅速用移液槍吸取1.0 mL復蘇培養(yǎng)基吹打混勻，轉移至1.5 mL的EP(eppendorf)管中，隨后37 ℃ 200 rpm培養(yǎng)3 h，然后將菌液濃縮后涂布到含50 μg/mL卡納霉素抗性的平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.2.5 酶活測定

將10 μL發(fā)酵上清液加入到190 μL 2%的殼聚糖溶液中，55 ℃反應15 min后加入300 μL DNS溶液，沸水浴10 min終止反應，取200 μL于OD540下測定其吸光度值[8]，通過DNS的標準曲線確定其最終酶活。

酶活定義：每分鐘水解殼聚糖產生1 μmol/L還原糖所需要的酶量為一個酶活單位(U)。

1.2.6 SDS-PAGE蛋白電泳

樣品處理：取48 h發(fā)酵液8 000 rpm離心10 min，菌體用等量pH 8.0的Tris-HCl緩沖液重新懸浮。加入1.0 mL溶菌酶置于37 ℃反應30 min，破壞其細胞壁。隨后超聲破碎20 min，破碎液在8 000 rpm條件下離心15 min。分別取發(fā)酵上清、破碎液上清和破碎后沉淀各32 μL加入8 μL 5×loading buffer，煮沸10 min。

2 結果與討論

2.1 殼聚糖酶OUC-Csn21c的異源表達

構建的質粒如圖1a所示，將殼聚糖酶ouc-csn21c插入到質粒pP43NMK中。以鏈霉菌S.albolongusATCC 27414基因組為模板，成功擴增殼聚糖酶ouc-csn21c基因序列。圖1b為殼聚糖酶ouc-csn21c擴增結果，序列長度為804 bp。通過DNAMAN軟件預測該酶的分子量為29.6 kDa，蛋白電泳條帶與預測大小相符(圖1c)。

2.2 含分子伴侶PrsA和CsaA質粒的構建

將分子伴侶蛋白PrsA和CsaA分別插入到已構建成功的質粒pP43NMK-Csn21c上，同時用組成型啟動子Pshuttle09對分子伴侶進行誘導表達，質粒圖譜如圖2a、2b所示。分別擴增片段Pshuttle09、prsA和csaA，然后用引物43-09-F和prsA-R進行融合PCR，得到片段Pshuttle09-prsA，大小為1 218 bp，用引物43-09-F和csaA-R擴增得到片段Pshuttle09-csaA，大小為672 bp(圖2c)。陽性克隆鑒定結果顯示，質粒的相應位置插入與理論大小一致的片段(圖3)。測序結果顯示序列并未發(fā)生突變，表明質粒構建成功。

2.3 重組菌株的表達

2.3.1 分子伴侶PrsA和CsaA對殼聚糖酶OUC-Csn21c胞外酶活的影響

重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c在24 h時生長已進入穩(wěn)定期(圖4a)，OD600可達1.4左右。酶活基本在24 h時達到較高水平，之后基本保持穩(wěn)定。重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-PrsA(圖4b)和WB800/pP43NMK-Csn21c-CsaA(圖4c)在24 h時菌體濃度均已達到最高(OD600可達1.4)，重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-PrsA的胞外酶活同原始菌株相同，也在24 h時達到較高水平，之后基本保持穩(wěn)定，但是重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-CsaA在24 h后胞外殼聚糖酶OUC-Csn21c的酶活仍在增長，直到48 h酶活達到最高，之后略有下降。

由于重組菌株均在48 h酶活達到最高，所以取各重組菌株發(fā)酵48 h的酶活結果進行比較，分子伴侶CsaA可使胞外殼聚糖酶OUC-Csn21c的酶活提高21.83%(圖4d)，達4.76 U/mL。而分子伴侶PrsA卻使其酶活下降，可能是由于分子伴侶PrsA的過量表達抑制了殼聚糖酶OUC-Csn21c的表達。

2.3.2 分子伴侶PrsA和CsaA對殼聚糖酶OUC-Csn21c外源表達量的影響

根據以上胞外殼聚糖酶OUC-Csn21c的胞外酶活結果，可以初步確定分子伴侶CsaA可以使其胞外表達量提高，為進一步確認，本研究對重組菌株的胞內外蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳分析(圖5)，對比泳道5～8(胞外)發(fā)現(xiàn)，重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-CsaA的發(fā)酵液上清中，殼聚糖酶OUC-Csn21c的條帶較深，泳道1～4為細胞破碎液的上清(胞內)；在29.6 kDa處，重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c和WB800/pP43NMK-Csn21c-PrsA均有條帶，而重組菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-CsaA的條帶較淺。由此認為，分子伴侶CsaA可提高殼聚糖酶OUC-Csn21c的胞外分泌量。泳道9～12(包含體)可以看出，3個重組菌株的破碎液沉淀中均有與殼聚糖酶OUC-Csn21c大小一致的條帶，且條帶深淺基本一致，推斷分子伴侶PrsA和CsaA對殼聚糖酶OUC-Csn21c胞內的正確折疊無明顯促進作用。

3 結論

本研究以枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800為表達宿主，成功表達殼聚糖酶OUC-Csn21c，該酶分子量為29.6 kDa。經探究分子伴侶PrsA和CsaA對其胞外酶活的影響，發(fā)現(xiàn)分子伴侶CsaA可使其胞外酶活提高21.83%，為4.76 U/mL，而分子伴侶PrsA卻使其胞外酶活降低。進一步利用SDS-PAGE蛋白電泳對提高胞外表達量的原因進行分析，發(fā)現(xiàn)分子伴侶CsaA通過提高殼聚糖酶OUC-Csn21c的胞外分泌量來提高其胞外表達量。本研究為殼聚糖酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達提供了一定的參考價值。