林 盛，江澤斌，鄭付春，石剛剛

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床藥理實驗室，廣東 汕頭 515041)

急性心肌梗死是目前死亡率較高的一種疾病，臨床上常用經(jīng)皮冠狀動脈介入治療手術(shù)開通狹窄血管。缺血心肌組織恢復(fù)血流后，損傷卻進(jìn)一步加重，該現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷[1]。本課題組前期研究觀察到C57 小鼠腹腔注射維拉帕米(verapamil，Ver)1.0 mg/kg、硝苯地平(nifedipine，Nif)0.3 mg/kg、地爾硫?(diltiazem，Dil)0.5 mg/kg和碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide，F(xiàn)2)1.0 mg/kg，可以改善小鼠缺血再灌注后的心功能以及減少心肌酶的漏出[2]，該用藥劑量不引起鈣通道阻斷所致的血液動力學(xué)變化，我們稱之為“閾下劑量”。臨床研究方案中，以小鼠腹腔注射Ver“閾下劑量”為1.0 mg/kg 折算，患者口服Ver劑量是0.3 mg/kg，大多數(shù)患者體重在60～70 kg 之間，因此擬定口服Ver 20 mg 為“閾下劑量”。本研究測定患者口服Ver 20 mg 后的血藥峰濃度，以是否低于阻斷鈣通道所致血液動力學(xué)變化的最小有效濃度為標(biāo)準(zhǔn)，判斷其是否為閾下濃度；測定小鼠經(jīng)腹腔注射“閾下劑量”的Ver、Nif、Dil和F2的血藥峰濃度是否低于最小有效劑量的血藥濃度，判斷其是否為“閾下劑量”。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Ver 對照品(HPLC 級，純度≥99.0%，美國Sigma 公 司 ， 批 號 MKBV4993V)； Ver 注 射 液(上海禾豐制藥有限公司，批號43180401)；Nif 對照品(HPLC級，純度≥98.0%，美國Sigma公司，批號 MKCB9232)； Dil 對照 品(HPLC 級 ， 純 度≥99.0%，美國Sigma 公司，批號MKBW4898V)；F2對照品(HPLC 級，純度≥99.0%，批號20170309)；內(nèi)標(biāo)巴馬汀(palmatine，Pal)對照品(HPLC級，純度≥98.0%，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號B0613AS)。API 6500 型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國ABSCIEX 公司)；LC-30A 高效液相色譜儀(日本島津公司)。

1.2 實驗對象

臨床急性心肌梗死患者80例來源于汕頭市潮南民生醫(yī)院，本研究經(jīng)汕頭市潮南民生醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。C57BL/6JNifdc 小鼠，SPF 級，雄性，25～30 g，購自北京維通利華公司，許可證編號：SCXK(京)2016-0006。

1.3 給藥方案及血樣采集

急性心肌梗死患者隨機分組，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療手術(shù)前口服給藥：(1)實驗組50例，口服含20 mg Ver 注射液的溫水20 mL；(2)安慰劑組30例，口服溫水20 mL。給藥1.5 h(達(dá)峰時間1～3 h)后經(jīng)肘部靜脈采血1 mL，置于一次性靜脈血樣采集容器(EDTA-K2)，4 ℃，3 000 r/min 離心 10 min，-80 ℃冷凍貯存。

小鼠隨機分組，每組6 只，腹腔注射給藥。給藥方案及分組情況如下。(1)閾下劑量：Ver 1.0 mg/kg 組 ，Nif 0.3 mg/kg 組 ，Dil 0.5 mg/kg 組 ， F21.0 mg/kg 組；(2)最小有效劑量：Ver 1.5 mg/kg組，Nif 0.4 mg/kg 組，Dil 0.75 mg/kg 組，F(xiàn)21.5 mg/kg 組。Nif 組于給藥 5、10、15、20 min 后經(jīng)眼眶后靜脈叢采血，其他藥物組于給藥2、5、10、15 min后經(jīng)眼眶后靜脈叢采血。每個時間點采血210 μL，置于經(jīng)EDTA 處理的1.5 mL 離心管中，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，-80 ℃冷凍貯存。

1.4 血藥濃度測定

1.4.1 色譜和質(zhì)譜條件色譜柱為XB-C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，保護(hù)柱為 XB-C18(5 mm×2.1 mm，1.8 μm)。流動相為乙腈—水溶液(V乙腈∶V水=35∶65，含 2 mmol/L 甲胺與 6 mmol/L 甲酸)，流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量3 μL，運行時間11 min，內(nèi)標(biāo)為Pal。質(zhì)譜采用電噴霧離子源，多反應(yīng)正離子監(jiān)測(MRM)掃描模式。源電壓：5 300 V；源溫度：450 ℃；氣簾氣：35 psi(1 psi≈6.9 kPa)；碰撞氣：8 psi；霧化氣：45 psi；輔助氣：40 psi；Ver、Nif、Dil、F2、Pal 的監(jiān)測離子對分別為：m/z455.3→165.2，m/z378.2→315.1，m/z415.0→178.1，m/z432.2→165.1，m/z352.2→336.2。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的配制精密稱取各對照品，甲醇溶解并定容，分別配制成200 μg/mL的儲備液，置于-80 ℃冷凍貯存。取適量各分析物儲備液，以甲醇為溶劑配制含3.2 μg/mL Ver、1.6 μg/mL Nif、2.4 μg/mL Dil、2.4 μg/mL F2的混合工作液，逐級稀釋，與空白血漿配制含有2～400 ng/mL Ver、 1～200 ng/mL Nif、 1.5～300 ng/mL Dil、1.5～300 ng/mL F2的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。配制含有6、160、 320 ng/mL Ver， 3、 80、 160 ng/mL Nif，4.5、120、240 ng/mL Dil，4.5、120、240 ng/mL F2的低濃度(QCL)、中濃度(QCM)、高濃度(QCH)質(zhì)控樣品。內(nèi)標(biāo)Pal儲備液以甲醇為溶劑稀釋2次，配制成1 μg/mL的工作液。

1.4.3 血漿樣品處理取血漿樣品100 μL 至1.5 mL離心管中，加入1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)Pal 20 μL和乙腈300 μL，渦旋振蕩30 s，-10 ℃，12 000 r/min離心 10 min，取上清液 150 μL 經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾至進(jìn)樣瓶。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 選擇性通過比較6 批來自不同供體的空白血漿、標(biāo)準(zhǔn)曲線定量下限(LOQ)血漿樣品(添加了分析物和內(nèi)標(biāo))和真實血漿樣品的色譜圖，當(dāng)干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%，并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%時，即可以接受。

1.5.2 線性和范圍用9 個不同的校正濃度水平對方法的線性進(jìn)行評價，連續(xù)評價6 條標(biāo)準(zhǔn)曲線。以分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值對分析物濃度進(jìn)行最小二乘法回歸運算，加權(quán)系數(shù)1/x2，得到相應(yīng)的方程。

1.5.3 準(zhǔn)確度與精密度按1.4.2 配制4 個不同濃度水平(LOQ、QCL、QCM和QCH)的樣品，每批每個濃度水平6 份，連續(xù)6 批，按1.4.3 處理，進(jìn)樣分析，對批內(nèi)準(zhǔn)確度、批間準(zhǔn)確度、批內(nèi)精密度、批間精密度進(jìn)行統(tǒng)計，質(zhì)控誤差應(yīng)在±15%范圍內(nèi)(定量下限在±20%范圍內(nèi))。

1.5.4 回收率與基質(zhì)效應(yīng)按1.4.2 配制質(zhì)控樣品，每個濃度水平6 份，按1.4.3 處理后進(jìn)樣分析，各對照品峰面積與等濃度水平的甲醇溶液峰面積之比，即為樣品的回收率，要求相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在±15%范圍內(nèi)。使用6 批來自不同供體的空白血漿，從6 批基質(zhì)計算的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)該在±15%范圍內(nèi)，在2 個濃度水平(QCL和QCH)進(jìn)行。

1.5.5 代替基質(zhì)的驗證按1.4.2 配制人血漿的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、人血漿的質(zhì)控樣品3 份、小鼠血漿的質(zhì)控樣品及定量下限樣品各6份，連續(xù)6批，按1.4.3 處理后進(jìn)樣分析，對批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度與精密度進(jìn)行統(tǒng)計，質(zhì)控誤差在±15%范圍內(nèi)(定量下限在±20%范圍內(nèi))，符合方法學(xué)考察的標(biāo)準(zhǔn)，不影響分析物的定量。

1.5.6 穩(wěn)定性按1.4.2 配制質(zhì)控樣品，每個濃度水平3 份，共4 批，分別評估在室溫放置4 h、在進(jìn)樣器(10 ℃)放置20 h、反復(fù)凍融3 次與-80 ℃冷凍貯存3個月的穩(wěn)定性，偏差應(yīng)在±15%范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜結(jié)果

將5 種對照品溶液分別注入質(zhì)譜儀，電噴霧正離子模式能產(chǎn)生良好的質(zhì)譜響應(yīng)，Ver、Nif、Dil、F2、Pal 豐度最高的碎片離子分別是m/z165.2、m/z315.1、m/z178.1、m/z165.1、m/z336.2。見圖1。

圖1 對照品溶液質(zhì)譜圖

2.2 方法考察

2.2.1 選擇性在人和小鼠血漿中，Ver保留時間分別為2.81 min 與2.76 min，Nif 保留時間分別為9.43 min 與9.45 min，Dil 保留時間分別為1.79 min與1.77 min，F(xiàn)2保留時間分別為6.77 min 與6.72 min，內(nèi)標(biāo)Pal 保留時間分別為1.51 min 與1.53 min，均未觀察到來自內(nèi)源性物質(zhì)的干擾(圖2、圖3)，說明本方法具有良好的選擇性，且每種分析物在人和小鼠血漿的保留時間接近。

2.2.2 線性分析物的回歸方程相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，線性關(guān)系良好。

2.2.3 準(zhǔn)確度與精密度人血漿質(zhì)控樣品相對偏差與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在±15%范圍內(nèi)，人血漿定量下限樣品相對偏差與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在±20%范圍內(nèi)，符合中國藥典2015年版《生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》[3]對準(zhǔn)確度和精密度的要求。

2.2.4 回收率與基質(zhì)效應(yīng)人、小鼠血漿質(zhì)控樣品回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在±15%范圍內(nèi)，基質(zhì)效應(yīng)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在±15%范圍內(nèi)，符合《生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》[3]對基質(zhì)效應(yīng)的要求(回收率未作要求)。

圖2 急性心肌梗死患者血漿LC-MS/MS色譜圖

2.2.5 代替基質(zhì)的驗證小鼠血漿質(zhì)控樣品的相對偏差與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在±15%范圍內(nèi)(定量下限樣品在±20%范圍內(nèi))，符合方法學(xué)考察的標(biāo)準(zhǔn)[3]，不影響分析物的定量，見表1，后續(xù)實驗可以使用人血漿代替小鼠血漿配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.6 穩(wěn)定性由新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析穩(wěn)定性實驗的質(zhì)控樣品，結(jié)果表明，質(zhì)控樣品的偏差均在±15%范圍內(nèi)，說明在室溫放置4 h、進(jìn)樣器10 ℃放置20 h、反復(fù)凍融3 次與-80 ℃冷凍貯存3個月的穩(wěn)定性良好，符合《生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》對穩(wěn)定性的要求[3]。

2.3 方法學(xué)應(yīng)用

2.3.1 患者Ver“閾下劑量”血藥峰濃度測定本方法成功應(yīng)用于臨床急性心肌梗死患者的Ver 血藥峰濃度測定，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)前口服單劑量Ver注射液20 mg，在服藥后1.5 h經(jīng)肘部靜脈采血1 mL，含藥血漿按1.4.3處理進(jìn)樣。50例患者血樣中49 例的Ver 血藥峰濃度低于產(chǎn)生鈣通道阻斷作用的最小有效濃度20 ng/mL[4]，基本符合預(yù)期。見圖4。

2.3.2 小鼠鈣拮抗劑“閾下劑量”血藥峰濃度的測定本方法亦應(yīng)用于小鼠血漿中Ver、Nif、Dil和F2濃度的測定，“閾下劑量”鈣拮抗劑Ver、Nif、Dil、F2的血藥峰濃度分別是 62.62、85.28、44.52、99.87 ng/mL，均低于其最小有效劑量的血藥濃度84.58、97.45、45.55、133.00 ng/mL。見圖5。

圖4 急性心肌梗死患者的Ver血藥峰濃度

表1 分析物在小鼠血漿中批內(nèi)、批間的準(zhǔn)確度與精密度(n=6)

圖5 小鼠鈣拮抗劑“閾下劑量”與最小有效劑量血藥濃度

3 討論

鈣拮抗劑血藥濃度的測定方法已有報道[5-8]，但Nif的靈敏度不滿足本研究的需求。通過添加甲胺[9-11]，提高了Nif 的質(zhì)譜響應(yīng)，定量下限1 ng/mL滿足研究需求。根據(jù)《生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》[3]，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控樣品的基質(zhì)應(yīng)該與目標(biāo)實驗樣品基質(zhì)相同，改變其他基質(zhì)或物種需要部分方法驗證。代替基質(zhì)的研究已有報道[12-13]，本研究通過觀察選擇性、回收率、基質(zhì)效應(yīng)、準(zhǔn)確度與精密度，確證了人血漿可代替小鼠血漿配制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，減少小鼠的實驗數(shù)量。

本課題組前期研究結(jié)果表明，最小有效劑量的Ver、Nif、Dil 和F2引起小鼠血流動力學(xué)變化的時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于達(dá)峰時間，所以最小有效濃度難以確定[2]。本研究測得以上4種鈣拮抗劑“閾下劑量”的血藥峰濃度低于最小有效劑量的血藥濃度，結(jié)合前期研究“閾下劑量”未引起鈣通道阻斷所致的血液動力學(xué)變化，基本確定腹腔注射Ver 1.0 mg/kg、Nif 0.3 mg/kg、Dil 0.5 mg/kg 和 F21.0 mg/kg 是不引起鈣通道阻斷所致血液動力學(xué)變化的閾下劑量。

另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)臨床急性心肌梗死患者Ver 血藥峰濃度低于臨床最小有效濃度，確定了急性心肌梗死患者口服Ver 注射液20 mg 是Ver的閾下劑量。根據(jù)臨床術(shù)前環(huán)境，本研究選擇口服注射液的給藥方式，考慮到劑型的差異是否影響Ver 血藥濃度，也測定了口服Ver 注射液20 mg與片劑20 mg的血藥峰濃度，結(jié)果表明，兩種劑型的血藥峰濃度差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.29)。

綜上所述，本研究證實了急性心肌梗死患者口服Ver注射液20 mg的劑量是閾下劑量，小鼠腹腔注射Ver 1.0 mg/kg、Nif 0.3 mg/kg、Dil 0.5 mg/kg和F21.0 mg/kg 的劑量也基本確定為閾下劑量，為應(yīng)用鈣拮抗劑治療心肌缺血再灌注損傷采用的“閾下劑量”提供了佐證。