曹滿雄，江迦典，洪佳瓊，陳芾珩

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 汕頭 515041)

血小板無(wú)力癥是一常染色體隱性遺傳性疾病，主要是由于血小板膜糖蛋白Ⅱb(glycoproteinⅡb，GPⅡb)和(或)糖蛋白Ⅲa(glycoprotein Ⅲa，GPⅢa)的質(zhì)或量的異常導(dǎo)致[1]。GPⅡb 和 GPⅢa 分別由血小板整合素α2b 亞單位(integrin subunit α2b，ITGA2B)和整合素β3 亞單位(integrin subunit β3，ITGB3)基因編碼。人ITGA2B和ITGB3基因均位于17號(hào)染色體上，分別由30個(gè)外顯子和15個(gè)外顯子組成[2]，二者可發(fā)生缺失突變[3]、插入突變[4]、堿基置換突變[5]、剪接突變[6]等。致病性的變異可通過(guò)影響GPⅡb/Ⅲa 的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及功能，進(jìn)而影響血小板的聚集功能[7]。

隨著測(cè)序技術(shù)廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)新突變的可能性變得更大。構(gòu)建細(xì)胞或小鼠疾病模型等進(jìn)行致病性分析成本昂貴，且體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)或種屬之間存在差異，使這種疾病模型的驗(yàn)證所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和臨床應(yīng)用存在一定的局限性。因此，通過(guò)生物信息學(xué)軟件來(lái)綜合分析新突變的致病性成為另一種簡(jiǎn)單可行的方法。在本研究中，我們報(bào)道了一新的ITGA2B基因突變，并采用生物信息學(xué)軟件對(duì)該新突變的致病性進(jìn)行分析，探討新的基因型和臨床表型之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

1個(gè)血小板無(wú)力癥家族(1例患者及3個(gè)家庭成員)納入了本次研究?；颊吲裕挲g28歲，主要因“自幼反復(fù)牙齦出血”多次住院，并有消化道大出血史。根據(jù)Solh等[8]對(duì)血小板無(wú)力癥的診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)，該患者屬于1 型血小板無(wú)力癥。根據(jù)改良的世界衛(wèi)生組織的出血評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[9]，該患者出血風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)為Ⅲ級(jí)。其他家庭成員無(wú)出血史，患者父母無(wú)近親結(jié)婚史。本研究通過(guò)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理號(hào)為：汕大醫(yī)附一院倫審-科研-第2020-082號(hào)。患者及家系成員均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

圖1 外周血涂片

1.2.1 表型分析血小板計(jì)數(shù)采用LH780 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)進(jìn)行檢測(cè)；凝血功能采用CS5100全自動(dòng)凝血分析儀(日本希森美康公司)進(jìn)行檢測(cè)；血管性血友病因子(vWF)送至廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心利用免疫比濁法進(jìn)行檢測(cè)；外周血涂片行瑞氏-吉姆薩染色后顯微鏡下觀察血小板形態(tài)；血栓彈力圖采用CFMS LEPU-8800血栓彈力圖儀(北京樂(lè)普醫(yī)療科技有限責(zé)任公司)進(jìn)行檢測(cè)。用EDTA 抗凝管采集患者及家庭成員全血后送至廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，采用FASCCantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD 公司)分別檢測(cè)血小板表面CD41(GPⅡb)、CD61(GPⅢa)、CD42b的表達(dá)。

1.2.2 DNA 測(cè)序分析EDTA 抗凝管采集患者全血，送至深圳荻碩貝肯精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)有限公司進(jìn)行全外顯子測(cè)序， 采用Agilent Sureselect Target Enrichment 系統(tǒng)進(jìn)行外顯子捕獲，然后用Hiseq X測(cè)序儀(美國(guó)Illumina 公司)進(jìn)行雙末端測(cè)序，最后采集家系其他成員全血進(jìn)行一代測(cè)序以確定ITGA2B基因突變?cè)诩蚁抵蟹植记闆r。

1.2.3 新突變位點(diǎn)空間結(jié)構(gòu)模型分析根據(jù)已知的GPⅡb/GPⅢa 蛋白結(jié)構(gòu)模型，構(gòu)建突變位點(diǎn)的蛋白質(zhì)空間模型，采用SWISS-MODEL 軟件分析突變位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的影響。

2 結(jié)果

2.1 表型分析結(jié)果

患者及其母親、哥哥的血小板計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、纖維蛋白原(Fib)、血小板形態(tài)(圖1)等均基本正常?；颊哐“寰奂δ苊黠@下降，血小板CD41(GPⅡb)和CD61(GPⅢa)表達(dá)均明顯下降、CD42b表達(dá)正常，其家庭成員CD41、CD61 及CD42b 表達(dá)均正常(表1)?；颊哐苄匝巡∫蜃涌乖?vWF:Ag)：103.0%(正常參考范圍50.0%～160.0%)。

2.2 全外顯子測(cè)序結(jié)果

全外顯子測(cè)序分析顯示：ITGA2B、VWF等9個(gè)與出血性疾病相關(guān)基因的位點(diǎn)發(fā)生突變(表2)，而ACTN1、ITGB3、ITGA2、RASGRP2、MYH9等可能與血小板無(wú)力癥致病相關(guān)的基因均未檢測(cè)到突變。

表1 患者家系基本情況及表型結(jié)果

表2 全外顯子測(cè)序部分結(jié)果

2.3 ITGA2B基因一代測(cè)序結(jié)果

圖2 ITGA2B基因c.1096C>T雜合突變

一代測(cè)序結(jié)果顯示，患者及患者姐姐檢測(cè)到ITGA2B： c.1096C>T 雜合突 變 (圖2)， 該突變 使ITGA2B基因12號(hào)外顯子的第1096號(hào)核苷酸由C突變成T，形成一個(gè)終止密碼子，為無(wú)義突變。該突變?cè)赑ubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中未檢索到，因此我們認(rèn)為是一新的突變。另外，患者、患者哥哥及患者母親檢測(cè)ITGA2B：c.1063G>A 雜合突變(圖3)，該突變使位于ITGA2B基因外顯子12 的第1063 號(hào)核苷酸由G突變成A，導(dǎo)致編譯的第355號(hào)谷氨酸變?yōu)橘嚢彼帷?/p>

圖3 ITGA2B基因c.1063G>A雜合突變

2.4 家系分析

家系分析顯示，ITGA2B：c.1096C>T 可能遺傳自患者父親(已故)，患者姐姐為該突變攜帶者；ITGA2B：c.1063 G>A 遺傳自患者母親，患者哥哥及母親為該突變攜帶者，見(jiàn)圖4。

2.5 新突變位點(diǎn)的蛋白空間結(jié)構(gòu)模型分析

ITGA2B：c.1096C>T(p.R366X)發(fā)生無(wú)義突變后，導(dǎo)致GPⅡb中的第366個(gè)氨基酸由X取代R氨基酸。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型分析顯示，該無(wú)義突變形成一個(gè)約含335 個(gè)氨基酸殘基的截短蛋白(1～31為信號(hào)肽)，導(dǎo)致GPⅡb不能與GPⅢa形成完整的復(fù)合物(圖5)。

圖4 家系圖譜

圖5 GPⅡb和GPⅡb/Ⅲa新突變位點(diǎn)空間結(jié)構(gòu)模型

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)ITGA2B基因發(fā)生了一個(gè)新的雜合突變：c.1096C>T，該無(wú)義突變使翻譯的GPⅡb蛋白縮短，最終形成一個(gè)約335 個(gè)氨基酸殘基的截短蛋白(1～31 為信號(hào)肽)。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)指南[10]，該變異為致病性位點(diǎn)。O’Toole 等[11]的研究顯示：一方面，無(wú)義突變后形成的截短的蛋白很不穩(wěn)定，合成后馬上在細(xì)胞內(nèi)降解；另一方面，因?yàn)槲磸?fù)合亞基的快速翻轉(zhuǎn)，截短的蛋白同時(shí)會(huì)導(dǎo)致GPⅢa 在血小板表面的明顯缺乏。這也解釋了本研究中盡管患者ITGB3基因未發(fā)生突變，但GPⅡb 和GPⅢa 的表達(dá)均明顯缺乏。綜上，突變后的GPⅡb明顯縮短，導(dǎo)致GPⅡb不能與GPⅢa形成完整的復(fù)合物，因此該新突變可能導(dǎo)致了血小板無(wú)力癥的發(fā)生。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)ITGA2B基因存在一個(gè)已知的錯(cuò)義突變：c.1063G>A。該突變可通過(guò)多種形式影響蛋白質(zhì)的功能。一方面，該突變位于GPⅡb 的第二個(gè)和第三個(gè)鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間，由于突變前的谷氨酸帶負(fù)電荷，突變后的賴氨酸帶正電荷，故該突變影響了此區(qū)域的電荷性質(zhì)[12]。另一方面，Basani等[13]的研究表明，該突變是通過(guò)影響不成熟GPⅡb/Ⅲa 復(fù)合物的構(gòu)象，使其不能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，致使前GPⅡb(Pro-GPⅡb)不能正常的剪切成重鏈和輕鏈，從而致病。本研究中，患者哥哥及母親只是攜帶者，尚有一個(gè)正常的等位基因可以合成正常的GPⅡb，故患者哥哥和母親的GPⅡb和GPⅢa表達(dá)正常，未發(fā)病。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的ITGA2B:c.1096C>T(p.R366X)突變，可能導(dǎo)致了血小板無(wú)力癥，但該突變的致病性仍需體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以獲取直接的致病性證據(jù)，進(jìn)一步闡明該突變導(dǎo)致血小板無(wú)力癥的發(fā)病機(jī)制。