謝燕丹，黃曉君，胡烈敏，謝思田

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭 515041；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院燒傷整形外科，廣東 汕頭 515041)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病尤其是冠心病的主要病理基礎(chǔ)。AS是一種彌漫性、全身性血管慢性炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致心、腦、腎等重要器官功能受損，其主要病理過(guò)程與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow density lipoprotein，ox-LDL)貫穿 AS 的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，損傷血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)多種炎癥因子分泌，促使巨噬細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，吞噬脂質(zhì)，形成脂質(zhì)斑塊[1-2]。在ox-LDL促分泌的眾多炎癥因子中，趨化因子是一大類可以被誘導(dǎo)的促炎癥細(xì)胞因子。單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是趨化因子中的一員。MCP-1 與趨化因子受體結(jié)合后，趨化和激活單核細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[3-4]。

目前，炎癥反應(yīng)在AS起始、進(jìn)展，以及斑塊的破裂、血栓形成等全過(guò)程中所起的關(guān)鍵性作用已獲得廣泛共識(shí)。因此，恢復(fù)抗炎平衡可能有助于穩(wěn)定AS 進(jìn)展，甚至逆轉(zhuǎn)AS 進(jìn)程。越來(lái)越多的證據(jù)表明，白細(xì)胞介素37(interleukin-37，IL-37)可顯著改變促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而減弱動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[5]。故本研究探討IL-37對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human coronary artery endothelial cells, HCAECs)分泌 MCP-1 的影響，為臨床應(yīng)用IL-37治療AS提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HCAECs 及其培養(yǎng)基、牛血漿纖連蛋白、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、內(nèi)皮細(xì)胞因子等購(gòu)自美國(guó)ScienCell 公司，ox-LDL、二甲基亞砜、MTT購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司，siIL-37 mRNA 及 IL-37b 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪基因公司，TRIzol、Lipofectamine?3000 Reagent、Opti-Men 等購(gòu)自美國(guó)Life Technologies 公司，PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTM及柱式法 Total RNA 提取試劑盒購(gòu)自日本Takara 公司，MCP-1 ELISA 試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)按HCAECs 培養(yǎng)說(shuō)明書(shū)操作要求，將25 cm2培養(yǎng)瓶表面按2 μg/cm2預(yù)處理牛血漿纖連蛋白，放置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜備用。將HCAECs 自液氮罐中取出，快速置于37 ℃恒溫水浴箱中，融化后種植到培養(yǎng)瓶中。當(dāng)細(xì)胞密度為5 000/cm2時(shí)，置37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液，此后隔2 d換液1次，細(xì)胞融合達(dá)70%時(shí)，隔1 d 換液1 次，至細(xì)胞融合達(dá)90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。選取第5代細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組第5代HCAECs接種于24 孔板上，細(xì)胞密度為4×104/孔，以內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)按Lipofectamine?3000 Reagent 說(shuō) 明書(shū)進(jìn) 行 轉(zhuǎn)染 操作。HCAECs 經(jīng) siIL-37 mRNA 或 IL-37b 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 24 h 后，再用 80 μg/mL ox-LDL 處理 24 h，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、未轉(zhuǎn)染ox-LDL 處理組、siRNA 陰性對(duì)照組、空白質(zhì)粒組。除空白對(duì)照組外，其余各組均用80 μg/mL ox-LDL處理。IL-37b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒每孔用量為500 ng，siIL-37 mRNA 每孔終濃度為40 nmol/L。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖各組細(xì)胞消化后制成細(xì)胞混懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)2、24 h后，每孔加入20 μL 0.5% MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用Multiskan Ascert 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(賽默飛世爾科技公司)測(cè)量各孔490 nm 的光密度(D)。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(MTT、培養(yǎng)基、二甲基亞砜)和對(duì)照孔(細(xì)胞、MTT、培養(yǎng)基、二甲基亞砜)。比較各組細(xì)胞增殖情況。

1.2.4 MCP-1 mRNA 表達(dá)的檢測(cè)RT-PCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞MCP-1 mRNA 的表達(dá)。操作步驟按Takara 公司的實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：37 ℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85 ℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng))。采用兩步法PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸及退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)。于每個(gè)循環(huán)的延伸階段采集熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后做95 ℃的熔解曲線分析。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，MCP-1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量用 2-ΔCT×1 000表示。MCP-1基因上游引物：5′-CATAGCAGCCACCTTCATTCC-3′；MCP-1基因下游 引 物 ： 5′-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTGG-3′。GAPDH上游引物：5′-CTGGGAGGAGAAGAT GC；GAPDH下游引物：ACCTTTGTTCCACGACC CATAG-3′。

1.2.5 MCP-1 蛋白表達(dá)的測(cè)定ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MCP-1蛋白水平。具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)：配置標(biāo)準(zhǔn)品并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；設(shè)置空白孔，分別將樣品及不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)孔中(100 μL/孔)；用封板膜封住反應(yīng)孔，室溫孵育120 min；洗板5 次，拍干；加入生物素化抗體，100 μL/孔，室溫孵育60 min；洗板5 次， 拍干。 加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Streptavidin，100 μL/孔，室溫避光孵育 20 min；洗板5 次，拍干；加入顯色劑TMB 溶液，100 μL/孔，室溫避光孵育15 min；加入終止液50 μL/孔，混勻后立即測(cè)量D(450)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較

各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，細(xì)胞的增殖能力的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后的增殖能力比較 (±s)

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后的增殖能力比較 (±s)

組別空白對(duì)照組未轉(zhuǎn)染ox-LDL處理組siIL-37 mRNA組siRNA陰性對(duì)照組IL-37b過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組空白質(zhì)粒組D(490)0.417±0.011 0.395±0.005 0.404±0.005 0.404±0.006 0.403±0.003 0.411±0.007

2.2 各組細(xì)胞MCP-1 mRNA的表達(dá)

未轉(zhuǎn)染ox-LDL 處理組細(xì)胞內(nèi)MCP-1 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比增加(P<0.05)。siIL-37 mRNA組的MCP-1 mRNA 與siRNA 陰性對(duì)照組相比增加(P<0.01)。IL-37b 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組的MCP-1 mRNA與空白質(zhì)粒組相比減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MCP-1蛋白的水平

未轉(zhuǎn)染ox-LDL 處理組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的MCP-1 蛋白的分泌量與對(duì)照組相比有增加(P<0.05)。siIL-37 mRNA 組的 MCP-1 蛋白分泌量較siRNA 陰性對(duì)照組增加(P<0.01)。IL-37b 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組的MCP-1 蛋白分泌量較空白質(zhì)粒組減少(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 各組細(xì)胞MCP-1 mRNA的表達(dá)

圖2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MCP-1蛋白的水平

3 討論

IL-37屬于白細(xì)胞介素1家族成員，已被證實(shí)為固有炎癥和免疫應(yīng)答的一種天然抑制因子[6]，具有抗炎和免疫抑制作用，是一種炎癥負(fù)性調(diào)控因子[7]。Ji等[8-10]研究發(fā)現(xiàn)，在AS斑塊及AS患者的血液循環(huán)中，IL-37水平均升高。外源性IL-37可抑制DC細(xì)胞的成熟并誘導(dǎo)T調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)，從而減輕ApoE?/?小鼠的AS癥狀。Liu等[11]研究發(fā)現(xiàn)IL-37轉(zhuǎn)基因ApoE?/?小鼠及ApoE?/?小鼠，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性IL-37能夠抑制ApoE?/?小鼠T調(diào)節(jié)細(xì)胞相關(guān)炎性因子的表達(dá)，如下調(diào)了TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12β和IFN-γ等的表達(dá)水平，IL-37能夠抑制DC細(xì)胞在體內(nèi)及體外的浸潤(rùn)和活化，IL-37發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制為IL-37 抑制DC 細(xì)胞經(jīng)IL-1R8-TLR4-NF-κB通路獲得活化功能，在AS模型ApoE?/?小鼠體內(nèi)，可觀察到AS 斑塊的縮小。McCurdy 等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，IL-37 能促使巨噬細(xì)胞由炎性特性的M1 亞型轉(zhuǎn)為具有抗炎特性的M2 亞型，從而發(fā)揮IL-37在AS過(guò)程中的抗炎作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL刺激正常狀態(tài)HCAECs，細(xì)胞培養(yǎng)上清可檢測(cè)到MCP-1 蛋白的分泌量增加，RT-PCR 檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)MCP-1 mRNA 的增加，提示ox-LDL 能夠促使HCAECs 發(fā)生炎性反應(yīng)。在本研究中，IL-37b 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞內(nèi)MCP-1 mRNA 合成減少，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MCP-1 蛋白水平也下降。而應(yīng)用siRNA 技術(shù)，內(nèi)皮細(xì)胞IL-37基因沉默后，受到ox-LDL刺激后內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1 mRNA和蛋白水平均較siRNA陰性對(duì)照組增加。這提示IL-37作為抗炎癥因子可以下調(diào)HCAECs 經(jīng)ox-LDL 刺激后MCP-1的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-37 對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)HCAECs分泌MCP-1有抑制作用。針對(duì)ox-LDL參與的AS，IL-37 拮抗炎性反應(yīng)有可能成為臨床治療的關(guān)鍵措施。