陳樹釗，黃文河，李瑤琛

(1.汕頭大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室，廣東 汕頭 515041；2.廈門大學附屬翔安醫(yī)院乳甲外科，福建 廈門 361101)

乳腺癌是當今女性發(fā)病率最高的癌癥[1]，近幾十年來，我國乳腺癌的發(fā)病率一直在上升[2]，迫切需要更有效的診斷方法，以便在早期診斷和治療乳腺癌。微小RNA(microRNA，miR)是一類小型非編碼內(nèi)源性RNA 分子，長度約為22 個核苷酸，從基因組DNA 轉錄成為長的初級轉錄物pri-miRNA，然后由RNase Ⅲ型Drosha和Dicer酶修飾以產(chǎn)生pre-miRNA和miRNA，通過與靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)(3′-untranslated regions，3′-UTR)部分互補結合，參與基因表達的轉錄后調(diào)控[3]。miR-199a通過靶向癌基因或腫瘤抑制因子或同時靶向兩者，直接或間接參與多種癌癥的發(fā)展。在乳腺癌中，miR-199a不僅與腫瘤的發(fā)生、進展及預后有關，而且還調(diào)節(jié)腫瘤對化療、放療的敏感性。本文就miR-199a在乳腺癌中的研究進展作一綜述。

1 miR-199a在乳腺癌中的表達

Wang 等[4]通過研究68 例乳腺癌患者和40 例健康患者的乳腺組織及血清樣本，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者組織和血清的miR-199a 水平明顯下調(diào)。Shin 等[5]使用微陣列芯片分析平臺，發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p在乳腺癌組織中的表達低于正常乳腺組織。而Zhang 等[6]利用血清直接多重qRT-PCR 對128個血清標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的血清miR-199a相對表達量是健康對照組的2.65 倍。Bockmeyer 等[7]利用TaqMan 低密度芯片分析了664 種microRNA，聚類分析發(fā)現(xiàn)，與乳腺正常管腔細胞相比，正?；准毎械膍iR-199a-3p顯著上調(diào)。與管腔A型、B型和基底樣型這3種乳腺癌亞型相比，乳腺惡性肌上皮瘤中的miR-199a-3p表達水平明顯上調(diào)，這表明正常乳腺基底細胞的microRNA 表型可能與乳腺惡性肌上皮瘤密切相關。此外，研究人員也通過確定正常乳腺上皮基底和管腔細胞中的microRNA 表達模式，發(fā)現(xiàn)該表達模式與不同乳腺癌亞型有一定的關系，這將助于人們更好地理解各種乳腺癌亞型的分化譜系和惡性轉化。Carter 等[8]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后乳腺癌早期組(產(chǎn)后診斷乳腺癌時間≤5.2 年)患者與晚期組(產(chǎn)后診斷乳腺癌時間≥5.3年)相比，miR-199a-5p的表達水平有所下調(diào)。

2 miR-199a的靶基因

miR-199a在腫瘤的增殖、侵襲、轉移和血管生成等生物學過程中發(fā)揮著重要作用，這與miR-199a 的靶基因功能密切相關。目前為止，在乳腺癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miR-199a下游靶基因有V-ets 成紅細胞增多癥病毒E26 癌基因同源物 1(erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1，Ets-1)、盤狀結構域受體1(discoidin domain receptor 1，DDR1)、Caveolin-2、核受體共阻遏因子(nuclear receptor corepressor，LCOR)、多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance protein 1，MRP1)、線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)、受體酪氨酸激酶Axl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4(serine/threonine protein kinase 4，PAK4)等。

2.1 Ets-1

Ets-1 是紅細胞增多癥病毒E26 癌基因轉錄因子家族一員，Ets-1與雌激素受體α、核受體輔激活物共同協(xié)作促進了乳腺癌細胞的增殖[9]。Li等[10]通過免疫組織化學染色法發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Ets-1 蛋白的表達與miR-199a-5p 的水平呈負相關，繼而在雙熒光素酶實驗中證實了miR-199a-5p 通過與Ets-1基因的 3′-UTR 序列作用，下調(diào)了 Ets-1 的活性。隨著Ets-1基因的敲除，β1整合素的水平下降，并降低了乳腺癌細胞MDA-MB-231 和MCF-7 的體外遷移和侵襲能力，這意味著miR-199a-5p/Ets-1/β1整合素信號軸抑制了乳腺癌腫瘤的進展。

2.2 DDR1

胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)是一種保守的分泌蛋白，影響哺乳動物的發(fā)育和代謝[11]。DDR1 是一種膠原蛋白受體酪氨酸激酶，是乳腺癌細胞中，IGF-Ⅰ受體的重要靶標[12]。Roberta 等[13]發(fā)現(xiàn)，隨著IGF-Ⅰ處理乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-231 時間的延長或IGF-Ⅰ劑量的增加，DDR1蛋白明顯上調(diào)，miR-199a-5p 下調(diào)。在 MCF-7 細胞中，IGF-Ⅰ誘導 DDR1 蛋白上調(diào)的進程可以完全被磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)抑制劑所阻斷。雙熒光素酶報告實驗驗證了 miR-199a-5p 可以靶向 DDR1 的 3′UTR。myr-PKB 轉染MCF-7 和 MDA-MB-231 細 胞 后 ， miR-199a-5p 下 調(diào) ，DDR1 上調(diào)。這些結果提示IGF 可能通過激活PI3K/PKB/miR-199a-5p 途徑導致DDR1 表達增加。對于過表達IGF-Ⅰ的乳腺癌細胞，通過調(diào)控PI3K/PKB/miR-199a-5p/DDR1信號軸有可能成為一種重要的乳腺癌治療途徑。

2.3 Caveolin-2

Caveolin-2 是細胞膜穴樣凹陷的結構蛋白。Shatseva等[14]通過細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p 可以增加內(nèi)皮細胞和乳腺癌細胞的增殖能力，通過生物信息學篩選發(fā)現(xiàn)Caveolin-2 的 3′UTR 中存在 miR-199a-3p 的 2 個潛在靶位點，在隨后進行的熒光素酶實驗中證實了Caveolin-2基因是miR-199a-3p 的靶基因。進一步發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-231細胞中過表達Caveolin-2 后，可削弱miR-199a-3p 的促乳腺癌細胞增殖活性，提示miR-199a-3p 靶向Caveolin-2 可能在乳腺癌進展中起重要作用。

2.4 TFAM

TFAM 對維持線粒體的生物合成及功能至關重要，參與腫瘤的發(fā)生和進展。TFAM 可以促進乳腺癌細胞增殖，降低雌激素受體陽性乳腺癌對順鉑化療的敏感性[15]。Fan等[16]通過熒光素酶實驗證明了TFAM基因是miR-199a的靶基因，在對順鉑(DDP)耐藥型MDA-MB-231(MDA-MB-231/DDP)細胞中，TFAM 過表達可減弱miR-199a-3p 過表達誘導的耐藥性。這些結果表明miR-199a-3p可能通過抑制TFAM的表達來減弱乳腺癌細胞對順鉑的耐藥性。

2.5 Axl

受體酪氨酸激酶Axl 可以通過結合生長因子將信號從細胞外基質(zhì)轉導到細胞質(zhì)中，有助于癌細胞的免疫逃逸和耐藥性，增強腫瘤侵襲和轉移能力[17]。Mudduluru等[18]利用生物信息學預測Axl可能受到miR-34a/miR-199a調(diào)控，將miR-34a 或 miR-199a 轉染 MDA-MB-231 細胞，這 2 種miRNA 在轉錄水平上共同競爭調(diào)節(jié)Axl。細胞侵襲和劃痕實驗顯示，miR-34a 和miR-199 顯著降低癌細胞的遷移和侵襲，甲基化特異性PCR 揭示了miR-34a、miR-199a 和Axl 啟動子在乳腺癌細胞中高甲基化，說明在癌癥中表觀遺傳修飾調(diào)控miRNA可能是一種普遍現(xiàn)象。

2.6 PAK4

Li 等[19]在 MDA-MB-231 細胞中過表達 miR-199a-3p后，抑制了細胞的生長、遷移和侵襲，而敲除PAK4基因則得到相反的結果。通過生物信息學分析和熒光素酶實驗驗證了PAK4是miR-199a-3p 的靶基因，隨著miR-199a-3p 的上調(diào)，磷酸化ERK、MEK 的表達下降，提示了miR-199a-3p通過抑制PAK4/MEK/ERK通路起到抗腫瘤作用。

2.7 LCOR

Celià-Terrassa 等[20]通過熒光素酶實驗證實了 LCOR 是miR-199a 的下游效應物，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-199a/LCOR 抑制了α干擾素的應答基因轉錄，由于癌癥干細胞對干擾素的反應較弱，可以逃避免疫監(jiān)視[21]。因此，若通過靶向miR-199a-LCOR 軸，乳腺癌癌癥干細胞可以對干擾素應答更敏感，進而削弱自身的免疫特權。

3 miR-199a與臨床病理特征的關系

Shin等[5]收集了5名三陰性乳腺癌患者的血清，采用受試者操作特征曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p 的表達水平越高，腫瘤的分期越低。ER/PR(+)和HER2(+)的腫瘤細胞中，miR-199a-5p的表達高于三陰性乳腺癌。Zhang等[6]收集了128 個血清樣本，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者miR-199a、miR-29c 和miR-424 的表達水平比健康對照組高，miR-199a、miR-29c和miR-424這3種microRNA 組合在一起區(qū)分乳腺癌患者與健康人群方面具有較高診斷準確性(AUC=0.888)。但這種miRNA 組合與臨床病理特征(如ER、PR、HER2)的相關性不顯著，Verderio等[22]認為可能是未結合上述3種microRNA的綜合評分從而造成了誤差，建議使用多變量分析方法分析。Celià-Terrassa等[20]通過Buffa數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p 高表達的ER(-)乳腺癌患者的無遠處復發(fā)生存率低于miR-199a-5p低表達患者。Jiang等[23]通過研究三陰性乳腺癌特異性數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p是三陰性乳腺癌的獨立預后標志物。miR-199a的表達與乳腺癌患者臨床預后、病理特征的關系仍未完全明確。

4 miR-199a對乳腺癌化療和放療敏感性的影響

Chang 等[24]發(fā)現(xiàn)linc00518 的敲除增強了耐藥型MCF-7細胞(MCF-7/ADR)對阿霉素，長春新堿和紫杉醇的化學敏感性，miR-199a 的下調(diào)可逆轉這種效應。Fan 等[16]發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231 和 MDA-MB-231/DDP 細 胞 中 ， miR-199a-3p 的表達水平明顯下調(diào)，過表達miR-199a-3p 可以增加MDA-MB-231/DDP細胞對DDP的敏感性。Shatseva等[14]分別對乳腺癌MT1細胞的miR-199a-3p進行過表達和抑制生成的處理，經(jīng)多烯紫杉醇處理后，發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p過表達后產(chǎn)生的凋亡細胞比例更高。這些研究表明miR-199a對提高乳腺癌化療藥物敏感性起到重要作用。

易賀慶等[25]分別在MDA-MB-231 細胞和MCF-7 細胞內(nèi)過表達miR-199a-5p，并給予電離輻射處理，發(fā)現(xiàn)與未過表達miR-199a-5p 的對照組相比，過表達miR-199a-5p的MDA-MB-231 細胞的增殖活性降低至90%，MCF-7 細胞則無明顯變化。通過熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231 細胞中，miR-199a-5p 與DRAM1和BECN1R基因結合并上調(diào)其表達，從而激活自噬過程，并且增強電離輻射誘導的自噬；在MCF-7細胞內(nèi)，miR-199a-5p下調(diào)了DRAM1和BECN1R基因的表達，抑制了電離輻射誘導的自噬。這提示了miRNA自噬調(diào)控網(wǎng)絡在乳腺癌放療過程中起重要作用，在不同細胞背景下，miRNA對靶基因及生物功能的調(diào)控機制又有所區(qū)別。

5 小結

miR-199a在轉錄后水平調(diào)控抑癌基因或促癌基因的表達，在乳腺癌細胞的增殖、凋亡、轉移和侵襲等過程中起到重要作用，進而影響了癌細胞的臨床病理特征和預后，也影響化療、放療的敏感性。隨著對miR-199a 的深入研究，發(fā)現(xiàn)由于其靶基因作用的不同，miR-199a在乳腺癌中發(fā)揮著促癌或抑癌的雙重角色，其靶基因具體信號傳導機制和功能仍需進一步地深入探索。miR-199a能否成為乳腺癌早期篩選指標和靶向治療靶點尚需繼續(xù)研究。