葉航宇，葛巖巖，吳金英，詹緒良

（中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所暨廣東省水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510275）

TNF?α 屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis fac?tor， TNF)超家族，是一種具有促進(jìn)其它免疫因子產(chǎn)生、促進(jìn)細(xì)胞吞噬作用及趨化作用、提高活性氧的產(chǎn)生的細(xì)胞因子［1］，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中起重要的調(diào)節(jié)作用［2］。TNF?α 與兩種不同的跨膜結(jié)構(gòu)受體結(jié)合——TNF?R1、TNF?R2，向下傳遞信號(hào)。哺乳動(dòng)物中，TNF?R1 存在于多種細(xì)胞的表面，無(wú)論是膜結(jié)合型的還是游離型的TNF?α 都可以與TNF?R1 結(jié)合［3］，TNF?R1 受體胞內(nèi)含有死亡結(jié)構(gòu)域，同TNF?α 結(jié)合后可以激活細(xì)胞的凋亡途徑也可以激活細(xì)胞的抗凋亡途徑［4］。在高等脊椎動(dòng)物中，僅能在內(nèi)皮細(xì)胞和一些免疫組織的細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)TNF?R2，認(rèn)為T(mén)NF?R2 主要在淋巴系統(tǒng)中發(fā)揮作用［2，5?6］。TNF?R2僅能與膜結(jié)合型的配體結(jié)合，胞內(nèi)無(wú)死亡結(jié)構(gòu)域，能夠同下游TRAF 蛋白連接，激活NF?κB，JNK，EPK 等途徑介導(dǎo)細(xì)胞分化和細(xì)胞存活［7］。在小鼠中敲除TNF?R1基因，會(huì)增加其對(duì)李斯特菌(Listeria monocytogenes)的易感性并導(dǎo)致快速死亡［8］。因此，可以推測(cè)TNF?R1/R2 在機(jī)體抵抗微生物感染、維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)等活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。

TNF?α 其受體TNF?R1/R2 在魚(yú)類(lèi)先天免疫系統(tǒng)中同樣具有重要的生物學(xué)功能，至今已在金魚(yú)(Carassius aurutusL)［9］、牙鲆(Paralichthys oliva?ceus)［10］、虹 鱒(Oncorhynchus mykiss)［11］、草 魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)［12］和尼羅羅非魚(yú)(Oreo?chromis niloticus)［13］等中克隆得到TNF?α基因。對(duì)魚(yú)類(lèi)TNF?R1 和TNF?R2 受體的報(bào)道，最早是在牙鲆 中［14］，LPS(500 μg/mL) 刺 激 牙 鲆 外 周 血 后TNF?R1表達(dá)量明顯上升；ConA(50 μg/mL)和PMA(0.35 μg/mL)刺激后TNF?R2表達(dá)量同樣出現(xiàn)顯著性升高［15］。在金魚(yú)中也獲得兩種TNF?R1和TNF?R2基因，并且證明這兩種受體都能與金魚(yú)TNFα?1、TNFα?2 結(jié)合［16］，但是，關(guān)于尼羅羅非魚(yú)TNF?R1和TNF?R2基因與TNF?R 受體相關(guān)性的研究報(bào)道較少。

尼羅羅非魚(yú)是我國(guó)優(yōu)勢(shì)出口水產(chǎn)品，具有生長(zhǎng)快速、起捕率高、出肉率好等特點(diǎn)，但是，養(yǎng)殖中的疾病問(wèn)題也日益嚴(yán)重，常見(jiàn)的養(yǎng)殖過(guò)程中羅非魚(yú)病主要有細(xì)菌性疾病、真菌性疾病以及寄生蟲(chóng)性疾病，其中細(xì)菌性疾病包括鏈球菌病、氣單胞菌病、腸炎病等［16］。近年來(lái)大面積的鏈球菌病暴發(fā)，導(dǎo)致尼羅羅非魚(yú)養(yǎng)殖損失巨大，而導(dǎo)致羅非魚(yú)鏈球菌病的病原菌主要是無(wú)乳鏈球菌［2］。

無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)是革蘭氏陽(yáng)性菌，可引起新生兒敗血癥、腦膜炎，感染魚(yú)類(lèi)引發(fā)腦炎［17?18］。本研究以TNF?R1及TNF?R2基因入手，克隆了TNF?R1及TNF?R2基因全長(zhǎng)cDNA 序列，并與其他物種進(jìn)行同源性對(duì)比和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建；研究了TNF?R1及TNF?R2在健康羅非魚(yú)各組織中的表達(dá)分布，并對(duì)TNF?R1及TNF?R2基因表達(dá)量與脂多糖(LPS)、多聚肌苷酸?胞苷酸(Poly Ⅰ：C)和無(wú)乳鏈球菌相關(guān)性進(jìn)行了初步分析，旨在探究TNF?α/TNF?R 系統(tǒng)在羅非魚(yú)免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中所起的作用，為進(jìn)一步深入研究魚(yú)類(lèi)免疫機(jī)制提供理論依據(jù)和參考數(shù)據(jù)，并提高羅非魚(yú)健康養(yǎng)殖水平提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)和樣品采集

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)為尼羅羅非魚(yú)，購(gòu)自廣東廣州番禺廣東羅非魚(yú)良種場(chǎng)，體質(zhì)量400～500 g，實(shí)驗(yàn)前在0.4 m3的水族箱，28 ℃水溫，12 h/12 h 光周期，24 h 充氣和1 L/min 循環(huán)過(guò)濾水的條件下馴養(yǎng)1 周以上。選取健康尼羅羅非魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取樣過(guò)程所使用的塑料容器均為無(wú)RNase處理，取樣金屬器械經(jīng)180 ℃處理4 h 以上。取樣時(shí)先用MS?222(Sigma，美國(guó))麻醉實(shí)驗(yàn)魚(yú)，分別提取3 尾健康羅非魚(yú)的鰓、頭腎、脾臟、肝臟、腎臟、胃、心臟、腦、垂體、腸、皮膚、精巢和肌肉組織，用液氮速凍保存，然后放于-80 ℃冰箱備用。

1.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

用常規(guī)Trizol(Invitrogen， 美國(guó))抽提法從尼羅羅非魚(yú)脾臟中提取總RNA，具體步驟按照Trizol Reagent 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace(TaKaRa，日本)的操作說(shuō)明將得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，產(chǎn)物保存于?20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 TNF?R1與TNF?R2 cDNA的克隆和測(cè)序

根據(jù)NCBI 上已發(fā)表的魚(yú)類(lèi)：牙鲆、金魚(yú)和斑馬魚(yú)(Danio rerio)的相關(guān)cDNA 保守序列設(shè)計(jì)兼并引物(表1)。以尼羅羅非魚(yú)脾臟RNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。根據(jù)得到的TNF?R1與TNF?R2cDNA中間片段設(shè)計(jì)特異性引物(表1)進(jìn)行5??RACE 和3??RACE 反應(yīng)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)w=1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)E.Z.N.A?Gel Extraction(Omega BioTek)回收目的片段，將回收產(chǎn)物連接到pTZ57R/T (Fermentas， China)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α，測(cè)序由廣州Invitrogen 生物技術(shù)有限公司完成。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表1 用于羅非魚(yú)TNF?R1和TNF?R2克隆以及定量檢測(cè)所用引物Table 1 Primers for cloning of the tilapia TNF?R1&TNF?R2 and real?time quantitative PCR

1.4 生物信息學(xué)分析

核酸序列的同源性分析通過(guò)BLAST program(www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST)完成。信號(hào)肽序列以及剪切位點(diǎn)通過(guò)SignalP 3.0 (http：//www.cbs. dtu. dk/services/SignalP)預(yù)測(cè)?？缒そY(jié)構(gòu)域通過(guò)SACS MEMSAT2 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)系統(tǒng)(http：//www. sacs. Ucsf. edu/cgi?bin/memsat. py)預(yù)測(cè)。同源結(jié)構(gòu)域由Blastp 系統(tǒng)(http：//blast. ncbi. nlm.nih. gov/Blast. cgi)預(yù)測(cè)。DNAMAN 進(jìn)行多氨基酸序列的比對(duì)。MEGA6 用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，其中所使用到的氨基酸序列均是從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到。

1.5 Realtime PCR 分析

Realtime PCR 分析所用儀器為Roche LightCy?cler 480 分析儀，染料為SYBR Green Ⅰ(Toyobo，Japan)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品至少設(shè)3 個(gè)重復(fù)，分別提取健康羅非魚(yú)的鰓、頭腎、脾臟、肝臟、腎臟、胃、心臟、腦、垂體、腸、皮膚、精巢和肌肉的總RNA，根據(jù)TNF?R1與TNF?R2基因序列合成定量用特異性引物(表1)，以18S rRNA 為內(nèi)參基因，分析TNF?R1和TNF?R2mRNA的表達(dá)譜。

1.6 體外實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞孵育和免疫刺激

通過(guò)Ficoll?Paque PLUS(GE)密度梯度離心獲得羅非魚(yú)脾臟和頭腎白細(xì)胞，分別用濃度為10 μg/mL 的LPS 或50 μg/mL 的Poly Ⅰ：C 同白細(xì)胞孵育，陰性對(duì)照組添加等體積的PBS。所有細(xì)胞均在添加φ=10% FBS 的DMEM 組織培養(yǎng)基中27 ℃培養(yǎng)，設(shè)1、3 和6 h 3 個(gè)時(shí)間段，每個(gè)條件組均有3個(gè)以上重復(fù)。通過(guò)離心收集細(xì)胞，加入1 mL Trizol提取總RNA，最后通過(guò)Realtime PCR 檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中的TNF?α、TNF?R1和TNF?R2的表達(dá)情況。

1.7 在體實(shí)驗(yàn)：感染攻毒實(shí)驗(yàn)

無(wú)乳鏈球菌從患病羅非魚(yú)提取(由中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所李安興教授惠贈(zèng))，在腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，供攻毒實(shí)驗(yàn)使用。參考實(shí)驗(yàn)室前期研究已確定的半致死劑量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)操作為：5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組20 尾魚(yú)，5 個(gè)攻毒劑量：1×106CFU，5×106CFU，1×107CFU，5×107CFU，1×108CFU。最終選擇1×107CFU 作為半致死攻毒劑量。然后，將420尾尼羅羅非魚(yú)［平均體質(zhì)量(60±6) g，平均體長(zhǎng)(13±0.5) cm］分為14 組，每組30 尾魚(yú)。其中8 組為實(shí)驗(yàn)組，腹腔注射半致死攻毒劑量為1×107CFU/mL 的無(wú)乳鏈球菌菌液1 mL，其余6組為對(duì)照組，注射相同體積的沒(méi)有無(wú)乳鏈球菌的培養(yǎng)基。腹腔注射6、12 h 和1、2、3、4、5、6、7、10、14 d 后，于各時(shí)間點(diǎn)取羅非魚(yú)脾臟和頭腎樣品，實(shí)驗(yàn)組每組取1 尾魚(yú)，共8尾，對(duì)照組每組也取1尾魚(yú)，共6尾，通過(guò)Re?altime?PCR 檢測(cè)TNF?α、TNF?R1和TNF?R2基因的表達(dá)變化情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示，統(tǒng)計(jì)差異性用單因素方差分析(One?Way ANOVA 和Duncan’s檢測(cè))，0.05和0.01水平用來(lái)指示差異的顯著性，所有數(shù)據(jù)都采用SPSS Statistics 17.0分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 尼羅羅非魚(yú)TNF?R1和TNF?R2序列分析

通過(guò)RACE 技術(shù)克隆得到羅非魚(yú)TNF?R1的cDNA 全 長(zhǎng) 2 275 bp (GenBank) 注 冊(cè) 號(hào)KM676072 ，5?UTR 長(zhǎng)度為298 bp，3?UTR 長(zhǎng)度為642 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 335 bp。預(yù)測(cè)前體蛋白由444個(gè)氨基酸組成，N 端含有一個(gè)由31個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，其胞外區(qū)包含3個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域位于第213～236個(gè)氨基酸殘基之間，其胞內(nèi)區(qū)第303～438個(gè)氨基酸殘基組成死亡結(jié)構(gòu)域(圖1)。利用Clustal?W 軟件將羅非魚(yú)TNF?R1 氨基酸序列與其他硬骨魚(yú)類(lèi)以及高等脊椎動(dòng)物TNF?R1 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，包括：金魚(yú)(Carassius aurutusL.， ACR08664.1)、 斑 馬 魚(yú)(Danio rerio， NP_998355.1)、牙鲆(Paralichthys olivaceus， BAC65225.1)、非洲爪蟾(xenopus lae?vis， BAD36761.1)、小鼠(Mus musculus， NP_035739)、人(Homo sapiens， NP_001056)，顯示它們都含有3 個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)，每個(gè)CRD 含有6 個(gè)半胱氨酸，羅非魚(yú)TNF?R1 與斑馬魚(yú)TNF?R1序列一致性最高，為32%。

TNF?R2cDNA 長(zhǎng)1 719 bp(GenBank)注冊(cè)號(hào)KM676073，GC比例為46%，5?UTR 長(zhǎng)度為90 bp，3?UTR長(zhǎng)度為153 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 476 bp。預(yù)測(cè)前體蛋白由491 個(gè)氨基酸組成，N 端含有1 個(gè)由21 個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，其胞外區(qū)包含4 個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域由25 個(gè)氨基酸殘基組成，其胞內(nèi)不含死亡結(jié)構(gòu)域(圖2)。利用Clustal?W 軟件將羅非魚(yú)TNF?R2 氨基酸序列與其他硬骨魚(yú)類(lèi)以及高等脊椎動(dòng)物TNF?R2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，包括：金魚(yú)(Carassius aurutusL.，ACR08665.1) 、斑 馬 魚(yú)(Danio rerio， NP_001082979.1 )、牙 鲆 (Paralichthys olivaceus，BAC65226.1)、雞(Gallusgallus， NP_989770.2)、小鼠(Mus musculus， NP_035740.2)、人(Homo sapiens， NP_001057.1) ，顯示它們都含有4 個(gè)CRD 結(jié)構(gòu)域；羅非魚(yú)TNF?R2 與牙鲆TNF?R2 序列一致性最高，達(dá)49%。

圖1 利用Clustal?W 軟件分析尼羅羅非魚(yú)與其他物種TNF?R1氨基酸序列比對(duì)情況Fig.1 Analysis of TNF?R1 amino acid sequence alignment between Nile tilapia and other species using Clustal?W software

利用Mega6 構(gòu)建羅非魚(yú)TNF?R1、TNF?R2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，比較其與其他脊椎動(dòng)物TNFR基因序列進(jìn)化上的關(guān)系，各物種序列號(hào)如下：牙鲆TNF?R1(Paralichthys olivaceus， AB080946) 、金魚(yú)TNF?R1(Carassius aurutusL FJ905476)、斑馬魚(yú)TNF?R1(Danio rerio，BC162652.1) 、非洲爪蟾TNF?R1(Xenopus laevis， BAD36761)、牛TNF?R1(Bos Taurus， O19131) ， 豬TNF?R1(Sus scrofa， NP_999134) 、小鼠TNF?R1(Mus mus?culus， NP_035739) 、人TNF?R1(Homo sapi?ens， NP 001056) ；金魚(yú)TNF?R2(Carassius au?rutusL FJ905477) 、斑馬魚(yú)TNF?R2(Danio re?rio，NP_001082979.1) 、牙鲆TNF?R2(Parali?chthys olivaceus，BAC65226.1)、雞TNF?R2(Gal?lus gallus， NP_989770) 、牛TNF?R2(Bos Tau?rus， NP_001035580)、 豬TNF?R2(Sus scrofa，NP_001090910) 、小鼠TNF?R2(Mus musculus，NP_035740)、人TNF?R2(Homo sapiens， NP_001057) 。結(jié)果如圖3，所有的TNF?R1 氨基酸序列聚集成一簇，包括硬骨魚(yú)類(lèi)、爬行類(lèi)、哺乳類(lèi)動(dòng)物，而所有的TNF?R2氨基酸序列聚集成另外一簇。進(jìn)一步分析表明羅非魚(yú)TNF?R1 與牙鲆、金魚(yú)、斑馬魚(yú)同源性相對(duì)較高，與非洲爪蟾及哺乳動(dòng)物進(jìn)化距離相對(duì)較遠(yuǎn)；羅非魚(yú)TNF?R2與牙鲆同源性最高，其次為斑馬魚(yú)、金魚(yú)，與雞及其他高等哺乳動(dòng)物同源性較低。

圖2 利用Clustal?W 軟件分析羅非魚(yú)與其他物種TNF?R2氨基酸序列比對(duì)情況Fig.2 Analysis of TNF?R2 amino acid sequence alignment between tilapia and other species using Clustal?W software

2.2 尼羅羅非魚(yú)TNF?R1 和TNF?R2 的組織表達(dá)分析

圖3 基于尼羅羅非魚(yú)TNF?R1 和TNF?R2氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.3 Phylogenetic tree showing the relationship of tilapia TNF?R1 and TNF?R2 amino?acid sequence with other identified TNFR sequences

Real?time PCR 檢 測(cè) 了 羅 非 魚(yú)13 個(gè) 組 織 中TNF?R1(圖4A)和TNF?R2(圖4B)基因表達(dá)水平，TNF?R1在鰓中表達(dá)水平最高，其次是頭腎、脾臟，然后是肝臟、腎臟、胃、精巢、大腦、心臟和腸，表達(dá)量最低的則是垂體、皮膚和肌肉。與其相似的是，TNF?R2表達(dá)量最高的也是在鰓中，然后是頭腎、肝臟，接著是脾臟、心臟、腎臟、大腦、胃、皮膚、腸，最低的是垂體、肌肉和精巢，且這3個(gè)組織的表達(dá)水平非常的低。

2.3 尼羅羅非魚(yú)TNF?α、TNF?R1 和TNF?R2 的體外刺激表達(dá)分析

使用質(zhì)量濃度10 μg/mL LPS 和50 μg/mL PolyⅠ：C 分別刺激羅非魚(yú)頭腎白細(xì)胞和脾臟白細(xì)胞，在1 、3 和6 h 后 用 熒 光 定 量PCR 檢 測(cè)TNF?α、TNF?R1和TNF?R2基因mRNA 水平的表達(dá)變化，結(jié)果如圖5和圖6所示。

羅非魚(yú)的頭腎白細(xì)胞體外刺激后，TNF?α表達(dá)量在LPS 刺激1 h 后和在3 h 時(shí)變化不明顯，在6 h 時(shí)TNF?α表達(dá)量明顯升高；對(duì)于Poly Ⅰ：C 刺激，TNF?α的表達(dá)量在刺激后1 h 即出現(xiàn)明顯升高(圖5A)。TNF?R1在LPS刺激1 h到3 h時(shí)表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但是在LPS 刺激6 h 時(shí)顯著升高；對(duì)于Poly Ⅰ：C刺激，TNF?R1的表達(dá)量在刺激后1 h處上升，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，并逐漸接近同對(duì)照組表達(dá)量持平(圖5B)。TNF?R2在LPS 刺激下的表達(dá)情況與TNF?R1相似，也呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)；對(duì)于Poly Ⅰ：C 刺激，TNF?R2在1 h 和3 h時(shí)表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而在6 h 時(shí)明顯升高(圖5C)。

在羅非魚(yú)的脾臟白細(xì)胞體外刺激實(shí)驗(yàn)中，TNF?αmRNA的表達(dá)量在LPS刺激1 h后有所降低，在3 h 時(shí)出現(xiàn)上升，在6 h 時(shí)TNF?α表達(dá)量保持上升；對(duì)于Poly Ⅰ：C刺激，TNF?α的表達(dá)量在刺激后即出現(xiàn)明顯升高(圖6A)。TNF?R1的表達(dá)量在LPS 刺激后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)里呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)，對(duì)于Poly Ⅰ：C 刺激，TNF?R1的表達(dá)量在3 h 內(nèi)變化不大，而在6 h 時(shí)顯著升高(圖6B)；TNF?R2在LPS 刺激下也呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)；對(duì)于Poly Ⅰ：C 刺激，TNF?R2的表達(dá)變化趨勢(shì)與TNF?α相似，即先升高再下降(圖6C)。

2.4 尼羅羅非魚(yú)TNF?R1 和TNF?R2 的體內(nèi)刺激表達(dá)分析

羅非魚(yú)腹腔注射半致死劑量1x107CFU/mL 的無(wú)乳鏈球菌后，通過(guò)熒光定量PCR 的方法檢測(cè)了TNF?α、TNF?R1和TNF?R2三個(gè)基因在頭腎(圖7)及脾臟(圖8)中的表達(dá)水平變化。

從圖7 中可以看出：在頭腎中，TNF?α除了12 h 時(shí)間點(diǎn)外，在6 h～5 d 時(shí)間段內(nèi)的表達(dá)量均上調(diào)，在6 d～10 d 時(shí)間段表達(dá)量下調(diào)至本底，但在14 d表達(dá)量上調(diào)。TNF?R16 h～4 d內(nèi)都有表達(dá)量上調(diào)，在4 d 處達(dá)到最大值，5 d～10 d 時(shí)間段表達(dá)退至本底，至14 d 處又出現(xiàn)明顯的上升；TNF?R2在攻毒6～4 d 時(shí)間段表達(dá)上調(diào)(2 d 上調(diào)不明顯)，在12 h處達(dá)到最大值，而在隨后的時(shí)間段均下調(diào)至本底水平。

圖5 LPS或Poly Ⅰ：C孵育刺激尼羅羅非魚(yú)頭腎淋巴白細(xì)胞后TNF?α(A)、TNF?R1(B)和TNF?R2(C)的表達(dá)檢測(cè)Fig.5 Real?time PCR analysis expression profiles of tilapia TNF?α(A)，TNF?R1(B)and TNF?R2(C)post stimula?tion of LPS or Poly Ⅰ：C in head kidney leukocytes

從圖8中可以看到：在脾臟中，TNF?α在攻毒6～12 h 時(shí)間點(diǎn)即表達(dá)上調(diào)，隨后1～6 d 時(shí)間段的表達(dá)量均較低，僅略高于本底水平，但在7～14 d 時(shí)間段有表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)。TNF?R1在12 h～3 d 時(shí)間段表達(dá)上調(diào)，在2 d 處表達(dá)量最高，隨后保持逐步下降趨勢(shì)，14 d 處略微上升。TNF?R2在12 h～1 d時(shí)間段上調(diào)，在12 h 處達(dá)到最大值，隨后下調(diào)。

3 討 論

圖6 LPS 或Poly Ⅰ：C孵育刺激尼羅羅非魚(yú)脾臟淋巴白細(xì)胞后TNF?α(A)、TNF?R1(B)和TNF?R2(C)的表達(dá)檢測(cè)Fig.6 Real?time PCR analysis expression profiles of tilapia TNF?α (A)，TNF?R1(B)and TNF?R2(C)post stimu?lation of LPS or Poly Ⅰ：C in spleen leukocytes

本研究應(yīng)用RACE 技術(shù)克隆得到了尼羅羅非魚(yú)TNF?R1和TNF?R2的cDNA 全長(zhǎng)序列，并進(jìn)一步分析了它們的序列特征以及進(jìn)化的地位。經(jīng)蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，尼羅羅非魚(yú)TNF?R1 和TNF?R2 均屬于Ⅰ型跨膜蛋白，TNF?R1 胞外區(qū)含有3個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，TNF?α通過(guò)識(shí)別該區(qū)域來(lái)判定結(jié)合的可能性，其胞內(nèi)區(qū)具有死亡結(jié)構(gòu)域，這與其它已知脊椎動(dòng)物的TNF?R1的結(jié)構(gòu)非常相似，但是，哺乳動(dòng)物如鼠［15］、人類(lèi)［19］等中CRD數(shù)目為4 個(gè)，而尼羅羅非魚(yú)TNF?R2 與哺乳動(dòng)物TNF?R2 結(jié)構(gòu)相似，胞外區(qū)含有4 個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，但胞內(nèi)無(wú)死亡結(jié)構(gòu)域，該特征是劃分TNF?R1和TNF?R2的重要依據(jù)。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，尼羅羅非魚(yú)TNF?R1、TNF?R2 分別與脊椎動(dòng)物TNF?R1、TNF?R2 氨基酸序列聚類(lèi)，且兩者分支明顯，進(jìn)一步證明了克隆的兩種基因確為羅非魚(yú)TNF?R1和TNF?R2。同時(shí)，TNF?R1 和TNF?R2 胞外區(qū)同源性高，但胞內(nèi)區(qū)差別很大，暗示著它們具有與TNF?α 結(jié)合的能力，但胞內(nèi)主要的信號(hào)傳遞途徑會(huì)有所不同。而TNF?R1 和TNF?R2 信號(hào)通路存在交叉，即兩者相互作用可介導(dǎo)凋亡或者存活信號(hào)［2］，預(yù)測(cè)在羅非魚(yú)體內(nèi)TNF?R1 和TNF?R2具體的生物學(xué)功能復(fù)雜，可能受多種因素調(diào)控。

圖7 無(wú)乳鏈球菌感染后TNF?α(A)、TNF?R1(B)和TNF?R2(C)在頭腎中的表達(dá)Fig.7 Head kidney expression pattern of TNF?α(A)，TNF?R1(B)and TNF?R2(C)following infection of S. agalactiae

圖8 無(wú)乳鏈球菌感染后TNF?α(A)、TNF?R1(B)和TNF?R2(C)在脾臟中的表達(dá)Fig.8 Spleen expression pattern of TNF?α(A)，TNF?R1(B)and TNF?R2(C)following infection of S. agalactiae

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)TNF?R1 和TNF?R2組織表達(dá)模式分析結(jié)果，TNF?R1和TNF?R2在鰓中表達(dá)量較高，而鰓是抵抗病原菌入侵的第一道防線，因此，這兩種基因在鰓中的高表達(dá)可能與其免疫功能相適應(yīng)，這與金魚(yú)［16］、牙鲆［10］、黑巖魚(yú)［20］和蝦夷扇貝［21］中報(bào)道的結(jié)果相似；TNF?R1和TNF?R2在頭腎和脾臟等二級(jí)淋巴免疫器官中同樣具有高水平表達(dá)，預(yù)示著TNF?R1 和TNF?R2 在羅非魚(yú)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。

已知TNF?R1和TNF?R2是腫瘤壞死因子TNF?α 的受體，TNF/TNFR 系統(tǒng)在脊椎動(dòng)物的先天性免疫(非特異性免疫)和獲得性免疫(特異性免疫)中發(fā)揮著非常重要的作用，可以參與抵抗多種病原微生物的感染［22?23］。在體外實(shí)驗(yàn)中，LPS刺激羅非魚(yú)頭腎白細(xì)胞后，在6 h 內(nèi)TNF?α有顯著的上調(diào)，這與虹鱒頭腎巨噬細(xì)胞LPS 刺激后TNF?α顯著上調(diào)結(jié)果相似［21］，TNF?R1在LPS 刺激6 h 后表達(dá)量也有明顯的上升，與牙鲆白細(xì)胞LPS 刺激后TNF?R1上調(diào)結(jié)果相似［10］，不同的是牙鲆TNF?R1在刺激后1 h 即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，而后趨于對(duì)照組水平，這印證了不同魚(yú)類(lèi)免疫器官間存在異質(zhì)性及功能上的差別。另外Poly Ⅰ：C 刺激后，頭腎白細(xì)胞 中TNF?α、TNF?R1表 達(dá) 量 在1 h 即 有 上 升，TNF?R2的表達(dá)量在6 h 才有上升；而Poly Ⅰ：C 刺激脾臟白細(xì)胞后TNF?α、TNF?R2表達(dá)量1 h 處即有上調(diào)，TNF?R1表達(dá)上調(diào)時(shí)間相對(duì)滯后，6 h 處才出現(xiàn)上升(圖6)。以上體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在脾臟白細(xì)胞與頭腎白細(xì)胞中，同種基因表達(dá)上調(diào)時(shí)間和強(qiáng)度有區(qū)別，原因可能是不同免疫器官的白細(xì)胞組成成分差異較大，導(dǎo)致它們對(duì)同種刺激物反應(yīng)有所差異。綜上所述，兩種刺激物刺激后不同組織中3 種基因表達(dá)的變化情況，可推知TNF?α與TNF?R1基因在應(yīng)對(duì)LPS 模擬的細(xì)菌入侵刺激中起主要作用，而TNF?R2則在應(yīng)對(duì)Poly Ⅰ：C 模擬的病毒入侵刺激中發(fā)揮重要作用，可以推測(cè)當(dāng)外源細(xì)菌或病毒入侵時(shí)，這3種基因可能參與免疫應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

無(wú)乳鏈球菌感染在羅非魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中非常普遍，一些防治魚(yú)類(lèi)鏈球菌病的方法，例如抗生素、益生菌、疫苗等［4，24?26］也在陸續(xù)開(kāi)發(fā)中，但直到現(xiàn)在仍未有非常有效的預(yù)防和治療措施。為了進(jìn)一步了解羅非魚(yú)體內(nèi)免疫應(yīng)激調(diào)節(jié)特征，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了在體實(shí)驗(yàn)，即對(duì)羅非魚(yú)進(jìn)行無(wú)乳鏈球菌腹腔注射攻毒實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了先天性免疫的生物學(xué)標(biāo)志物TNF?α 及其受體TNF?R1、TNF?R2 的表達(dá)情況。在羅非魚(yú)腹腔注射鏈球菌的前12 h 內(nèi)，頭腎及 脾 臟 組 織 中TNF?α、TNF?R1、TNF?R2的mRNA 表達(dá)量均有迅速上升(圖7～8)，這與體外實(shí)驗(yàn)中LPS 刺激頭腎白細(xì)胞后，TNF?α、TNF?R1和TNF?R2的mRNA 表達(dá)水平上調(diào)趨勢(shì)是相吻合的，Zhu 等［27］報(bào)道的海豚鏈球菌(Streptococcus ini?ae)攻毒后的羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也顯示出TNF?α和TNFR基因表達(dá)的明顯上調(diào)。攻毒后7 d內(nèi)3個(gè)基因的表達(dá)量均有先上升后下降的趨勢(shì)，這可能與細(xì)胞避免過(guò)激的免疫炎癥反應(yīng)以及病原菌的暫時(shí)被抑制有關(guān)，同時(shí)病原菌的防御機(jī)制也可能抑制魚(yú)體免疫因子的表達(dá)［28］。本實(shí)驗(yàn)第14 天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的TNF?αmRNA 的表達(dá)水平明顯升高，死亡率出現(xiàn)上升(文中數(shù)據(jù)未體現(xiàn))，推測(cè)可能與體內(nèi)病原菌再次繁殖引起魚(yú)體的炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此，我們預(yù)估羅非魚(yú)感染鏈球菌病原菌后兩周內(nèi)進(jìn)行輔助治療效果更佳，尚需要后續(xù)更為系統(tǒng)的研究證實(shí)。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明TNF?R1 和TNF?R2可能參與了羅非魚(yú)免疫應(yīng)答過(guò)程，并初步揭示了它們?cè)诿庖哒{(diào)控系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，對(duì)羅非魚(yú)的健康養(yǎng)殖具有一定參考價(jià)值。