劉梓燊，楊國(guó)旺

（1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，北京100010；2. 首都醫(yī)科大學(xué)，北京100069）

肺癌是全球惡性腫瘤中最常見的一種，也是主要的致死癌種。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer，IARC)在2018 年發(fā)布的GLOBOCAN 2018 文章中顯示，2018 年全球肺癌新發(fā)病例占惡性腫瘤新發(fā)病例的11.6%，死亡數(shù)目占18.4%［1］。中國(guó)衛(wèi)生健康統(tǒng)計(jì)年鑒收錄了三次中國(guó)惡性腫瘤死亡抽樣回顧調(diào)查，結(jié)果顯示肺癌的死亡率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，現(xiàn)已居首位［2］。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展和對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的深入，肺癌的治療方法逐漸豐富，西醫(yī)多采用手術(shù)、化療、放療、靶向、免疫等治療方法，但患者預(yù)后欠佳，5 年生存率低。中醫(yī)藥在惡性腫瘤的治療中應(yīng)用范圍廣，配合放化療、靶向治療、免疫治療等，可以增強(qiáng)治療效果、減輕毒副反應(yīng)、提高患者生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期等。

腫瘤患者的發(fā)病因素復(fù)雜，且疾病的發(fā)生發(fā)展需要一定的過程，“虛、瘀、毒”是其中重要的病因病機(jī)［3］，最后往往表現(xiàn)出虛實(shí)夾雜的癥狀。所以在治療方面，不能單獨(dú)針對(duì)實(shí)證應(yīng)用祛邪的方法，還需兼顧扶正，針對(duì)患者的病情，祛邪與扶正并用，相得益彰，達(dá)到更好的治療效果［4］?！端貑枴ぴu(píng)熱病論》中記載：“邪之所湊，其氣必虛”。另外，在《醫(yī)宗必讀》中記載“積之成也，正氣不足而后邪氣踞之?！狈伟┗颊卟∥辉诜?，且久病傷氣，導(dǎo)致肺氣虛，往往會(huì)出現(xiàn)乏力、咳嗽、自汗等癥狀。肺氣虛弱，“子盜母氣”，導(dǎo)致脾氣虛，出現(xiàn)納差、大便溏等癥狀。故臨床上常采用補(bǔ)肺益脾的方法治療。一項(xiàng)關(guān)于原發(fā)性支氣管肺癌中醫(yī)證型與病理類型的相關(guān)性研究結(jié)果顯示，肺癌患者以虛證多見，中醫(yī)證型中比例最高為氣虛證占22.1%、其次為氣陰兩虛證占17.5%［5］。

我國(guó)現(xiàn)存最早的本草著作《神農(nóng)本草經(jīng)》中，將藥物分為上、中、下三品，黃芪和白術(shù)被列為上品［6］。黃芪歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表、生津養(yǎng)血等功效。白術(shù)歸脾胃經(jīng)，具有健脾益氣、止汗等功效，為“脾臟補(bǔ)氣健脾第一要藥。”白術(shù)在補(bǔ)脾氣的同時(shí)，還能夠“培土生金”，補(bǔ)益肺氣。黃芪與白術(shù)相配伍，補(bǔ)益肺脾之氣較單味藥的力量更強(qiáng)，效果更好。一項(xiàng)基于關(guān)聯(lián)規(guī)則探索中醫(yī)藥治療晚期肺癌的辨證思路及用藥規(guī)律的研究結(jié)果表明，使用頻次居前三位的中藥是黃芪、麥冬、白術(shù)［7］。另有一項(xiàng)基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對(duì)肺癌的中醫(yī)藥治療進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在治療肺癌的處方中，黃芪使用頻率為91.67%，白術(shù)為84.37%［8］?？梢姺伟┗颊叩奶幏街校S芪、白術(shù)的應(yīng)用廣泛。但目前針對(duì)“黃芪—白術(shù)”在肺癌的防治作用機(jī)制方面缺乏深入研究。

針對(duì)中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究與其高度適配。為預(yù)測(cè)“黃芪—白術(shù)”在治療肺癌方面作用機(jī)制，本篇文章將通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)“黃芪—白術(shù)”的有效成分、作用靶點(diǎn)、蛋白互作、生物通路、信號(hào)通路進(jìn)行研究，分析潛在的作用關(guān)系，為其今后的研究提供參考和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 化學(xué)成分及化合物靶點(diǎn)的篩選

通過Traditional Chinese Medicine Systems Phar?macology Database and Analysis Platform (TCMSP)平臺(tái)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，檢索黃芪、白術(shù)的全部化學(xué)成分，并通過調(diào)整藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(ADME)對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行篩選獲得活性成分，相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：口服利用度(oral bioavailability，OB) ≥30，藥 物 相 似 性(drug?likeness，DL) ≥0.18。通過ADME 篩選后得到藥物活性成分，并基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出活性成分的潛在作用靶點(diǎn)，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www. uniprot.org/)對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選和標(biāo)準(zhǔn)化命名，篩選條件為“reviewed” “homo sapiens”，標(biāo)準(zhǔn)化命名為基因名稱。

1.2 疾病相關(guān)基因的篩選

以“肺癌”為關(guān)鍵詞分別在“TTD”數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//db. idrblab. net/ttd/)、DisGeNET 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(https：//www. disgenet. org/)和“OMIM”數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.omim.org/)進(jìn)行檢索，查找肺癌相關(guān)基因，并刪除重復(fù)靶點(diǎn)。

1.3 成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)的獲取

使用R 語言VennDiagram 擴(kuò)展包，對(duì)1.1 的成分潛在靶點(diǎn)與1.2 的疾病靶點(diǎn)取交集得到共同靶點(diǎn)，并繪制Venn圖。

1.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通 過 STRING (Version 11.0) 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(https：//string?db. org/)，對(duì)1.3 獲得的共同靶點(diǎn)進(jìn)行分析，設(shè)置蛋白種類為“homo sapiens”，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，使用Cytoscape3.7.2 軟件對(duì)結(jié)果可視化。

1.5 GO生物過程富集分析與KEGG通路富集分析

利用R 軟件3.6.3 中的Bioconductor 相關(guān)數(shù)據(jù)包(http：//www. bioconductor. org/)對(duì)1.4 獲得的靶蛋白進(jìn)行GO 生物過程富集分析和KEGG 通路富集分析，設(shè)置P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，輸出結(jié)果并繪制氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 “黃芪—白術(shù)”化學(xué)成分及潛在靶點(diǎn)

通過“TCMSP”數(shù)據(jù)庫(kù)共挖掘“黃芪—白術(shù)”中的全部化學(xué)成分，其中黃芪87 個(gè)，白術(shù)55 個(gè)。通過調(diào)整ADME 參數(shù)(OB≥30，DL≥0.18)，以及對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行Uniprot 篩選和標(biāo)準(zhǔn)化命名并去重后，共篩選出活性成分共19 個(gè)(見表1)，潛在作用靶點(diǎn)180 個(gè)(見圖1)。圖中藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為黃芪和白術(shù)，綠色節(jié)點(diǎn)為“黃芪—白術(shù)”的活性成分，橙色節(jié)點(diǎn)為“黃芪—白術(shù)”活性成分的潛在靶點(diǎn)，橙色的顏色越深，表明其度值越大，378 條邊代表活性成分與潛在靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。

2.2 疾病相關(guān)基因的篩選

以“肺癌”為關(guān)鍵詞分別在“TTD”數(shù)據(jù)庫(kù)、“DisGeNET”數(shù)據(jù)庫(kù)和“OMIM”數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，查找肺癌相關(guān)基因，刪除重復(fù)數(shù)據(jù)后剩余650個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)的獲取

通過R 語言Venn Diagram，對(duì)180 個(gè)成分潛在靶點(diǎn)與650 個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集，得到29 個(gè)共同靶點(diǎn)，這29 個(gè)共同靶點(diǎn)視為“黃芪—白術(shù)”治療肺癌的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)(見圖2)。

2.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“2.3”下得到的29 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(Version 11.0)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析，利用Cytoscape3.7.2 軟件對(duì)所獲取的靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(見圖3)。共有29 個(gè)靶蛋白發(fā)生相互作用，靶點(diǎn)的degree 值越大則形狀越大，代表靶蛋白之間互相作用的邊共187條。在該蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中平均度值為12.9，度值大于平均度值的靶點(diǎn)共12 個(gè)，將其從大到小排列，依次為：AKT1、 VEGFA、 EGFR、 ESR1、 CCND1、 IL6、PTGS2、ERBB2、CASP8、IL1B、CDKN1A、KDR，表明其在互作網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，可作為“黃芪—白術(shù)”藥對(duì)治療肺癌的重要預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

2.5 GO功能富集分析及KEGG信號(hào)通路富集分析

將29個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因提交至R 軟件Bioconduc?tor 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 功能富集分析，按照P＜0.05 進(jìn)行篩選，其中涉及生物過程1 260 個(gè)(見圖4)，細(xì)胞組分12 個(gè)(見圖5)，分子功能32 個(gè)(見圖6)。從生物過程富集分析中，主要涉及活性氧代謝過程、多細(xì)胞生物穩(wěn)態(tài)、不同營(yíng)養(yǎng)水平應(yīng)答反應(yīng)、外部刺激下的細(xì)胞應(yīng)答、類固醇激素反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、上皮細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激反應(yīng)、T 細(xì)胞活化等。從細(xì)胞組分富集分析中，靶點(diǎn)主要集中在膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)、囊腔、核染色質(zhì)等。從分子功能富集分析中，主要為蛋白磷酸酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、抗氧化活性、泛素連接酶結(jié)合、泛素樣連接酶結(jié)合、跨膜受體酪氨酸激酶活性、跨膜受體激酶活性、整合素結(jié)合、酪氨酸激酶活性、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合等。

表1 “黃芪—白術(shù)”篩選出的活性成分Table 1 The active ingredients of"Astragalus membranaceus ?Atractylodes macrocephala koidz"

將29 個(gè)靶蛋白基因提交至R 軟件Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路富集分析，按照P＜0.05 進(jìn)行篩選，其中涉及信號(hào)通路26 個(gè)(見圖7)。在信號(hào)通路富集分析，主要涉及PI3K?Akt 信號(hào)通路、粘著斑、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、內(nèi)分泌抵抗、鉑類耐藥性、HIF?1 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、細(xì)胞衰老、Rap1 信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路等。

3 討 論

根據(jù)研究結(jié)果進(jìn)行分析，“黃芪—白術(shù)”藥對(duì)中口服利用度最高的是黃芪中的活性成分MOL000378 7?O?甲基?異微凸劍葉莎醇，為74.69%，另外黃芪成分中的MOL000392 芒柄花黃素、 MOL000433 葉 酸、 MOL000380 (6aR，11aR)?9，10?二甲氧基?6a，11a?二氫?6H?苯并呋喃［3，2?c］鉻?3?醇以及白術(shù)中的活性成分MOL000022 14?乙?；?12?千里香酰?2E，8Z，10E?白術(shù)三醇的口服利用度排名前五，由此推測(cè)這些成分在口服“黃芪—白術(shù)”時(shí)起到重要的藥理學(xué)作用。

圖1 “藥對(duì)—化合物—靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)模型Fig.1 Network model of"drug pair?compound?target"

圖2 “黃芪—白術(shù)”藥對(duì)成分潛在靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)Venn圖Fig.2 Venn diagram of“Astragalus membranaceus ?Atractylodes macrocephala koidz”drug pair potential targets and lung cancer disease targets

對(duì)“藥對(duì)—化合物—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行分析，度值大于等于10 的靶點(diǎn)有11 個(gè)，占57.9%，從高到低依次為：槲皮素、山奈酚、7?O?甲基?異微凸劍葉莎醇、芒柄花黃素、異鼠李素、3，9?di?O?methylnissolin、(6aR， 11aR) ?9， 10?dime?thoxy?6a，11a?dihydro?6H?benzofurano ［3，2?c］chromen?3?ol、常春藤皂苷元、毛蕊異黃酮、3β?乙酰氧基蒼術(shù)酮、熊竹素。其中度值最高的是槲皮素，為137，說明其能與137 個(gè)靶點(diǎn)發(fā)生相互作用。槲皮素對(duì)多種惡性腫瘤［9?11］的增殖有抑制作用。一項(xiàng)研究證實(shí)，槲皮素可誘導(dǎo)降低MMP?9 的活性，對(duì)NSCLC A549 的凋亡起到了重要作用［12］。山奈酚具有抗癌作用，有研究證實(shí)，山奈酚能抑制NSCLC A549細(xì)胞侵襲和遷移能力［13］。另有研究證實(shí)，山奈酚能夠抑制SCLC H446 細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［14］。相關(guān)研究證實(shí)，芒柄花黃素對(duì)NSCLC A549 細(xì)胞有抑制其增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用［15］。相關(guān)研究證實(shí)，異鼠李素在體外和體內(nèi)試驗(yàn)均有抗腫瘤增殖的作用，其作用機(jī)制與誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)［16］。毛蕊異黃酮是《中國(guó)藥典》里記載的黃芪含量測(cè)定成分，相關(guān)研究證實(shí)，毛蕊異黃酮可抑制肺癌細(xì)胞A549 細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移［17］。除此之外，黃芪甲苷也是黃芪含量測(cè)定成分，本次因口服利用度、藥物相似性小于篩選標(biāo)準(zhǔn)，故在篩選時(shí)排除，但是相關(guān)研究結(jié)果證實(shí)，黃芪甲苷也具有抗腫瘤作用［18］。白術(shù)活性成分中，靶點(diǎn)度值最高為3β?乙酰氧基蒼術(shù)酮，度值為13，其次為8?β?乙氧基白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，度值為5，以及白術(shù)活性成分中口服利用度63.37%的14?乙?；?12?千里香酰?2E，8Z，10E?白術(shù)三醇，都屬于白術(shù)揮發(fā)油成分，相關(guān)研究證實(shí)，白術(shù)揮發(fā)油成分在抗腫瘤方面有一定的效果［19］。另外，在180 個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)中，有70 個(gè)靶點(diǎn)與至少2 個(gè)及以上的化合物相關(guān)，占38.9%。推測(cè)“黃芪—白術(shù)”藥對(duì)發(fā)揮著復(fù)雜的成分及靶點(diǎn)作用。

圖3 靶蛋白蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型(PPI)Fig.3 PPI network of target proteins

圖4 “黃芪—白術(shù)”預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因生物過程富集分析Top20Fig.4 Enrichment analysis of biological processes of predicted target genes of“Astragalus membranaceus ?Atractylodes macrocephala koidz”Top20

通過分析靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，度值大于平均度值的靶點(diǎn)共12個(gè)，從大到小前3位為：AKT1、VEGFA、EGFR。AKT 被認(rèn)為是一種癌基因，AKT1 是AKT 的重要亞型，相關(guān)研究表明，AKT1在NSCLC中表達(dá)上調(diào)［20］。相關(guān)臨床研究結(jié)果證明，AKT1 在NSCLC 發(fā)生過程中起促癌作用［21］。Folk?man［22］提出“腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成”，為抗腫瘤血管生成藥物提供了理論基礎(chǔ)。VEGF 是常見的血管生成刺激因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)是VEGF 中的一種。相關(guān)研究結(jié)果顯示，NSCLC 患者癌組織VEGFA 陽(yáng)性率高于癌旁組織［23］。VEGFA 與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)中的VEGFR2(又稱KDR)參與調(diào)控血管生成，其主要是通過對(duì)ERK、PI3K/Akt 等通路的調(diào)控，從而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［24］。目前針對(duì)抗血管生成藥物有大量的研究，比如臨床常用藥貝伐單抗可與VEGFA 結(jié)合，從而減少VEGFA 與受體結(jié)合，達(dá)到抑制血管生長(zhǎng)的目的［25］。EGFR是上皮生長(zhǎng)因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體。研究表明，在許多實(shí)體腫瘤中存在EGFR 的高表達(dá)或異常表達(dá)［26］。異常活化的EGFR 信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡的抑制、血管生成均有關(guān)聯(lián)。目前臨床已有多種針對(duì)EGFR 及其相關(guān)信號(hào)通路的靶向藥物，但其耐藥性，仍是目前需要解決的問題。

圖5 “黃芪—白術(shù)”預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因細(xì)胞組分富集分析Fig.5 Enrichment analysis of cellular component of predicted target genes of“Astragalus membranaceus ?Atractylodes macrocephala koidz”

圖6 “黃芪—白術(shù)”預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因分子功能富集分析Top20Fig.6 Enrichment analysis of molecular function of predicted target genes of“Astragalus membranaceus ?Atractylodes macrocephala koidz”Top20

圖7 “黃芪—白術(shù)”預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因信號(hào)通路富集分析Top20Fig.7 Enrichment analysis of KEGG pathway of predicted target genes of“Astragalus membranaceus ?Atractylodes macrocephala koidz”Top20

通過生物功能富集分析，發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)參與了多項(xiàng)生物過程，其中活性氧(ROS)代謝功能涉及11 個(gè)靶點(diǎn)，度值最高。ROS 的積累易導(dǎo)致基因突變，從而增加細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)，考慮與其破壞DNA、蛋白質(zhì)等有關(guān)系［27］。部分學(xué)者認(rèn)為適度增高的ROS 與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切聯(lián)系，包括參與腫瘤活化的初始階段、參與多階段的致癌過程、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［28?29］。與此同時(shí)，相關(guān)研究證明高濃度的ROS 能夠做到阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和壞死［30］。在臨床治療方面，部分化療藥物通過產(chǎn)生大量的ROS 殺傷腫瘤細(xì)胞，以達(dá)到治療目的。綜上，ROS 代謝功能的增高程度，對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展有不同的結(jié)局，所以針對(duì)ROS 的調(diào)控在腫瘤治療方面非常關(guān)鍵。

在KEGG 信號(hào)通路富集分析中發(fā)現(xiàn)，“黃芪—白術(shù)”藥對(duì)涉及多種信號(hào)通路，其中PI3K?Akt 信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，PI3K/AKT 信號(hào)通路與促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、化療耐藥性等有關(guān)［31］。另還有研究證實(shí)，通過抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路，能有效地逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對(duì)于順鉑的耐藥［32］。為腫瘤治療提供了新的思路，針對(duì)PI3K/AKT 信號(hào)通路的抑制劑是近年的研究熱點(diǎn)。有研究表明，EGFR 在肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等腫瘤中，存在過表達(dá)的現(xiàn)象。EGFR 的過表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤的生成、腫瘤血管的生成，以及腫瘤的轉(zhuǎn)移。EGFR酪氨酸激酶抑制劑的靶向藥物，為腫瘤的治療提供了新的方向，但靶向治療在取得治療效果的同時(shí)，仍需面臨繼發(fā)性耐藥的問題。針對(duì)晚期NSCLC 存在EGFR 基因突變的患者，第一、二代EGFR 酪氨酸激酶抑制劑在治療6 至13 個(gè)月時(shí)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，第三代則在治療9 至3 個(gè)月時(shí)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥［33］。延緩繼發(fā)性耐藥的時(shí)間，與患者的生存時(shí)間緊密相關(guān)。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)分析，“黃芪—白術(shù)”藥對(duì)在治療肺癌的過程中涉及多活性成分、多靶點(diǎn)和多信號(hào)通路，為今后的研究提供了參考和思路，但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)分析仍存在不足，比如未涉及到用藥劑量、用藥時(shí)間、用藥劑型、藥物相互作用等，針對(duì)此方面的問題，還有待相關(guān)研究的進(jìn)一步證實(shí)。