李 倩，許之揚(yáng)，周云龍，何 迪，白 玲，晏習(xí)鵬，阮文權(quán)*

1.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122 2.江蘇省環(huán)境厭氧生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

醋糟是麩皮、稻殼等輔料與高粱、糯米等主料經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后剩余的殘?jiān)渲饕煞譃槟举|(zhì)纖維素(纖維素、半纖維素和木質(zhì)素)[1]，產(chǎn)量巨大.厭氧消化是實(shí)現(xiàn)醋糟資源化和減量化的重要途徑[2]，然而木質(zhì)纖維素高度復(fù)雜和穩(wěn)定的聚合結(jié)構(gòu)極大地限制了醋糟厭氧消化效率[3].因此，強(qiáng)化木質(zhì)纖維素的水解是提高醋糟厭氧消化性能的關(guān)鍵.

關(guān)于提高木質(zhì)纖維素水解效率的研究主要?dú)w為兩類[4]：①通過化學(xué)、物理和生物等預(yù)處理方法，破壞木質(zhì)纖維素的致密結(jié)構(gòu)；②通過接種高效水解菌，生物強(qiáng)化厭氧體系中的木質(zhì)纖維素水解過程.前者雖能有效地改善木質(zhì)纖維素的水解效率，但很難避免處理過程中造成的二次污染以及實(shí)際應(yīng)用中的高成本等問題；相比之下，后者因無二次污染、工作量小、成本低等優(yōu)勢(shì)正被廣泛關(guān)注.反芻動(dòng)物的瘤胃被稱為天然纖維物質(zhì)的轉(zhuǎn)換器，其中含有的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、黃色瘤胃球菌屬(Ruminococcusflavefaciens)、白色瘤胃球菌屬(Ruminococcusalbus)和棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)都是公認(rèn)的木質(zhì)纖維素降解優(yōu)勢(shì)菌[5-7].HU等[8]在玉米秸稈厭氧批次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物要比傳統(tǒng)的厭氧污泥表現(xiàn)出更高的水解和酸化效率，可多產(chǎn)生28%的揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs).雖然瘤胃微生物對(duì)木質(zhì)纖維素能表現(xiàn)出更快和更好的降解潛能，但由于其中只含有少量產(chǎn)甲烷菌[9]，因此常采用兩相消化工藝(分離水解相和產(chǎn)甲烷相)來研究瘤胃微生物對(duì)木質(zhì)纖維素類底物的水解強(qiáng)化.例如，ZHANG等[10]采用兩相消化工藝，將瘤胃液水解后的稻秸用于產(chǎn)甲烷，最終單位質(zhì)量底物甲烷產(chǎn)量達(dá)285 mL/g(以VS計(jì))，是未經(jīng)瘤胃液處理的對(duì)照組的1.9倍.雖然兩相消化工藝效果顯著，但在實(shí)際運(yùn)行過程中很難實(shí)現(xiàn)水解相和產(chǎn)甲烷相的嚴(yán)格分開，且該方法工作量大，難以大規(guī)模應(yīng)用[11].因此，若能在同一相中實(shí)現(xiàn)水解和產(chǎn)甲烷，無疑對(duì)瘤胃微生物強(qiáng)化醋糟水解的實(shí)際應(yīng)用具有重要意義.

已有關(guān)于瘤胃生物強(qiáng)化的研究大多停留在厭氧消化效能評(píng)估的層面，且微生物對(duì)環(huán)境變化較為敏感，因此有必要深入探究生物強(qiáng)化過程中的菌群變化，揭示瘤胃微生物強(qiáng)化的機(jī)理.基于16S rRNA的研究方法常被用于定性分析厭氧體系中微生物多樣性，但木纖維素降解功能與微生物多樣性并非密切相關(guān)[12].相比之下，微生物定量分析對(duì)于深入探究厭氧體系強(qiáng)化機(jī)制更具意義.檢測(cè)編碼木質(zhì)纖維素降解蛋白基因則是實(shí)現(xiàn)微生物定量的重要手段之一，該方法能直接提供有效的代謝功能信息[7].厭氧環(huán)境中，木質(zhì)纖維素降解菌主要分布于糖苷水解酶家族5(glycoside hydrolase family，GH5)、GH9和GH48中[13].其中，GH5為最大的糖苷水解酶家族之一[14]，與木質(zhì)纖維素的降解效果密切相關(guān).因此，GH5水解基因的定量結(jié)果可用于表征瘤胃強(qiáng)化體系的木質(zhì)纖維素水解效果.

針對(duì)前期工作中醋糟厭氧消化木質(zhì)纖維素利用率低的問題[15]，該研究采用瘤胃微生物為接種物，以前期工作確定的最高有機(jī)負(fù)荷為起始有機(jī)負(fù)荷，在25 L的臥式厭氧反應(yīng)器中進(jìn)行連續(xù)式運(yùn)行，通過逐步提升反應(yīng)體系有機(jī)負(fù)荷來考察瘤胃強(qiáng)化體系物料處理能力的提升效果，分析各有機(jī)負(fù)荷下底物的降解規(guī)律，并通過定量分析關(guān)鍵水解菌群，深入研究瘤胃微生物強(qiáng)化木質(zhì)纖維素水解機(jī)制，以期為該方法的工業(yè)化應(yīng)用提供數(shù)據(jù)和理論支撐.

1 材料與方法

1.1 底物與接種物

醋糟由江蘇省鎮(zhèn)江市某食醋生產(chǎn)企業(yè)提供，存于冰箱備用.厭氧污泥為前期工作中醋糟厭氧體系中的厭氧消化污泥[15]，瘤胃污泥為實(shí)驗(yàn)室長期處理秸稈產(chǎn)氣效果良好的瘤胃污泥.厭氧污泥和瘤胃污泥基于TS(總固體)含量按3∶2的比例混合，取25 L混合污泥接種于反應(yīng)器中.醋糟和接種物的主要參數(shù)見表1.

表1 醋糟和接種物的性質(zhì)Table 1 Characteristics of vinegar residue and inocula

1.2 反應(yīng)裝置和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為保證進(jìn)出料和沼液的均質(zhì)化，試驗(yàn)選用體積為30 L的臥式反應(yīng)器，其有效工作體積為25 L，反應(yīng)器裝置如圖1所示.反應(yīng)器上部設(shè)有進(jìn)料口、出氣口和視鏡，下部設(shè)有出料口，進(jìn)出料采用螺帶式輸送.出氣口與濕式氣體流量計(jì)(LMF-1，長春汽車濾清器有限公司)和便攜式紅外沼氣分析儀(Gasboard-3200L，武漢立方光電有限公司)相連，分別用于測(cè)定產(chǎn)氣量和甲烷含量.將從出料口排出的消化液進(jìn)行固液分離，沼渣烘干用于組分分析，沼液補(bǔ)水回流至反應(yīng)器.

圖1 臥式厭氧消化反應(yīng)器Fig.1 Horizontal anaerobic digestion reactor

反應(yīng)器共運(yùn)行6個(gè)階段，各階段具體運(yùn)行參數(shù)見表2，其中，P1階段對(duì)應(yīng)的有機(jī)負(fù)荷為前期工作中醋糟厭氧體系的最高有機(jī)負(fù)荷.厭氧消化溫度控制在(37±1)℃，采用間歇式攪拌，攪拌速率為4 r/min，體系的含固率為14%±1%.每天定時(shí)進(jìn)料，每2 d出料一次，留樣并測(cè)定相關(guān)指標(biāo).

表2 各階段運(yùn)行參數(shù)Table 2 Operation parameters of each stage

1.3 測(cè)定參數(shù)及方法

總固體(TS)和揮發(fā)性固體(VS)含量采用干重法測(cè)定[16]；C和N元素含量采用元素分析儀(Vario MICRO cube，德國Elementar公司)測(cè)定；粗蛋白含量為凱氏定氮儀(KDN-520，杭州綠博儀器有限公司)測(cè)得的凱氏氮含量乘以6.25[17]；對(duì)于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量，將沼渣于50 ℃下烘干至恒質(zhì)量，采用范式洗滌法[18]，利用纖維素分析儀(ANKOM 2000i，美國ANKOM公司)測(cè)定；對(duì)于氨氮和VFAs含量，將沼液以 12 000 r/min離心15 min，用蒸餾水稀釋上清液，分別采用納氏試劑分光光度法[16]和總量比色法[19]進(jìn)行測(cè)定；pH采用pH計(jì)(Delta320，瑞士Mettler Toledo公司)進(jìn)行測(cè)定；TS和木質(zhì)纖維素降解率計(jì)算方法見式(1).

D=(Min-Mout-Macc)/Min×100%

(1)

式中：D為TS、纖維素、半纖維素或木質(zhì)素的降解率，%；Min為各階段內(nèi)添加至體系中TS、纖維素、半纖維素或木質(zhì)素的總質(zhì)量，g；Mout為各階段內(nèi)排出體系的TS、纖維素、半纖維素或木質(zhì)素的總質(zhì)量，g；Macc為各階段內(nèi)體系中TS、纖維素、半纖維素或木質(zhì)素的總質(zhì)量，g.

1.4 GH5絕對(duì)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)(Q-PCR)

a) 提取DNA.每個(gè)泥樣用0.85%的鹽水洗滌3次，去除其中的腐殖質(zhì)[20].按照DNeasy PowerSoil Kit(QIAGEN，德國)的說明書提取DNA，用超微量分光光度計(jì)(BioDrop DUO，英國Biochrom公司)檢測(cè)DNA模板的濃度和純度，置于-20 ℃下保存.

b) 構(gòu)建質(zhì)粒.GH5的特異性引物cel5_392F和cel5_754R[13]〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕按照表3所示的程序擴(kuò)增目的基因.擴(kuò)增體系包括：PCR Master Mix(2×)〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕12.5 μL，正、反引物和DNA模板各1 μL以及9.5 μL ddH2O(雙蒸水)〔寶生物工程(大連)有限公司〕，在MJ MiniTMPCR擴(kuò)增儀(MJ Mini，美國Bio-Rad 公司)上進(jìn)行反應(yīng).PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，切割目的條帶，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕回收純化PCR產(chǎn)物.純化產(chǎn)物與載體pMD19-T〔寶生物工程(大連)有限公司〕連接，熱擊將其導(dǎo)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109〔寶生物工程(大連)有限公司〕，LB培養(yǎng)基平板涂布培養(yǎng)12 h，隨機(jī)挑取白色菌落進(jìn)行液體擴(kuò)培，SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕提取質(zhì)粒，并通過PCR驗(yàn)證陽性質(zhì)粒.

c) 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.將陽性質(zhì)粒按10倍梯度(1010～104)稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做3個(gè)平行.絕對(duì)Q-PCR的25 μL反應(yīng)體系包括：TBTMPremix Ex TaqTMⅡ(寶生物工程有限公司，大連)12.5 μL，正、反引物和模板DNA各1 μL以及9.5 μL ddH2O.絕對(duì)Q-PCR使用實(shí)時(shí)定量PCR儀(Rotor-Gene Q，德國Qiagen公司)，擴(kuò)增程序如表3所示.繪制GH5的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，基于循環(huán)閾值Ct(cycle threshold，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))可計(jì)算出每個(gè)樣品中GH5基因拷貝數(shù).

表3 絕對(duì)Q-PCR的引物序列及擴(kuò)增程序Table 3 Primer sequences and amplification program of absolute Q-PCR

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)氣變化情況

如圖2所示，P1～P6階段單位質(zhì)量底物沼氣產(chǎn)量分別為422、434、446、437、451和352 mL/g(以VS計(jì)),相應(yīng)的單位質(zhì)量底物甲烷產(chǎn)量分別為242、247、255、248、261和183 mL/g(以VS計(jì)).沼氣中甲烷含量變幅較小，維持在55%左右.單位質(zhì)量底物產(chǎn)氣逐漸升高并保持在較高水平(除P6階段外)，可以看出，瘤胃強(qiáng)化體系在有機(jī)負(fù)荷提升過程中逐漸展現(xiàn)出其優(yōu)良的產(chǎn)甲烷性能.有機(jī)負(fù)荷提升初期，底物對(duì)瘤胃強(qiáng)化體系中微生物的沖擊作用導(dǎo)致產(chǎn)氣短暫性下降[15]；隨著微生物逐漸適應(yīng)新的有機(jī)負(fù)荷，產(chǎn)氣恢復(fù)直至穩(wěn)定.當(dāng)有機(jī)負(fù)荷升至P6階段水平時(shí)，單位質(zhì)量底物沼氣和甲烷產(chǎn)量均降至較低水平，此時(shí)運(yùn)行時(shí)間滿32 d(該有機(jī)負(fù)荷下的物料停留時(shí)間)，說明瘤胃強(qiáng)化體系對(duì)該有機(jī)負(fù)荷強(qiáng)度下出現(xiàn)了明顯的不適應(yīng)，物料處理能力顯著降低.該瘤胃強(qiáng)化體系共運(yùn)行131 d，P1～P5階段運(yùn)行至單位質(zhì)量底物產(chǎn)氣量穩(wěn)定所需的運(yùn)行時(shí)間呈下降趨勢(shì)，分別為28、22、16、16和18 d，說明瘤胃微生物與原體系菌群之間逐漸形成穩(wěn)定的協(xié)同效應(yīng)，對(duì)底物的適應(yīng)能力不斷增強(qiáng).

圖2 有機(jī)負(fù)荷提升過程中單位底物沼氣和甲烷產(chǎn)量的變化Fig.2 Changes of biogas and methane production per unit substrate with the increase of organic loading rates

有機(jī)負(fù)荷和單位質(zhì)量底物產(chǎn)氣是研究醋糟厭氧消化最基本的參數(shù)[21].由于醋糟中木質(zhì)纖維素的難降解性，前期工作獲得的最高有機(jī)負(fù)荷只有5.83 g/(L·d)，單位質(zhì)量底物沼氣和甲烷產(chǎn)量分別為418和223 mL/g[15].經(jīng)瘤胃微生物強(qiáng)化之后，瘤胃強(qiáng)化體系的最高有機(jī)負(fù)荷達(dá)8.90 g/(L·d)時(shí)，處理能力是原體系處理能力的1.53倍，相應(yīng)的單位質(zhì)量底物沼氣和甲烷產(chǎn)量更是高達(dá)451和261 mL/g，與原體系產(chǎn)氣相比分別提升了7.89%和17.8%.顯然，無論是有機(jī)負(fù)荷還是單位質(zhì)量底物產(chǎn)氣量，瘤胃強(qiáng)化后的厭氧消化體系對(duì)醋糟的處理能力都顯著提升.綜上，醋糟厭氧體系經(jīng)瘤胃微生物強(qiáng)化之后，表現(xiàn)出了更佳的單位質(zhì)量底物產(chǎn)氣和處理能力，顯著提升了醋糟的資源化利用效率.

2.2 發(fā)酵環(huán)境穩(wěn)定性分析

發(fā)酵環(huán)境的穩(wěn)定是影響厭氧體系沼氣產(chǎn)率的關(guān)鍵因素之一.VFAs、氨氮濃度和pH的變化都會(huì)影響微生物活性，進(jìn)而影響厭氧消化效率，所以VFAs、氨氮濃度和pH被認(rèn)為是重要的厭氧消化系統(tǒng)穩(wěn)定性指標(biāo)[22-23].

如圖3(a)(b)所示，在連續(xù)運(yùn)行過程中，氨氮和VFAs濃度有著相同的變化趨勢(shì)，即先升后降.有機(jī)負(fù)荷提升初期，水解微生物快速利用底物，導(dǎo)致VFAs濃度升高，積累的VFAs隨著體系產(chǎn)甲烷活性的逐漸增強(qiáng)而被利用，這與2.1節(jié)得到的產(chǎn)氣結(jié)果一致.同時(shí)，醋糟中的蛋白質(zhì)以及因底物沖擊消亡的微生物體被分解釋放出氨氮，隨著微生物的合成，積累的氨氮的代謝速率提高而逐漸被消耗.隨著反應(yīng)器的連續(xù)運(yùn)行，VFAs濃度的波動(dòng)幅度逐漸減緩，VFAs的消耗速率與生成速率很快達(dá)到平衡，說明連續(xù)的底物刺激促使了瘤胃微生物與原厭氧菌群逐漸形成穩(wěn)定的菌群關(guān)系，體系的穩(wěn)定性增強(qiáng).P1～P5階段，VFAs的最終濃度分別為2.28、2.62、2.29、1.96和1.85 g/L，雖然VFAs的最終濃度處于下降趨勢(shì)，但單位質(zhì)量底物產(chǎn)氣量始終處于高水平(見2.1節(jié))，說明體系中的水解產(chǎn)物VFAs能被產(chǎn)甲烷菌高效轉(zhuǎn)化為沼氣；而P6階段，VFAs濃度由1.85 g/L降至1.54 g/L，纖維素和半纖維素的低降解率(見2.3節(jié))是VFAs濃度降低的直接原因.P6階段氨氮濃度持續(xù)降低，可能是因?yàn)轶w系對(duì)蛋白質(zhì)的水解能力達(dá)到飽和狀態(tài)，醋糟中的蛋白質(zhì)未被充分降解利用.

圖3 有機(jī)負(fù)荷提升過程中VFAs、氨氮濃度和pH的變化Fig.3 Changes of VFAs,ammonia nitrogen concentration and pH with the increase of organic loading rates

從圖3(c)可以看出，在氨氮和VFAs的共同作用下，體系的pH維持在7.0～7.5之間.雖然有機(jī)負(fù)荷提升初期出現(xiàn)了VFAs積累的情況，但體系并未發(fā)生酸化，這是因?yàn)榘钡梢蕴峁┏渥愕膲A度[23-24]，且氨氮和VFAs濃度相同的變化趨勢(shì)更有助于維持厭氧消化體系內(nèi)的酸堿平衡.厭氧消化體系中，水解菌和產(chǎn)甲烷菌生長的最適pH范圍分別為5.3～8.3和6.5～8.2[22,25]，穩(wěn)定且弱堿性的發(fā)酵環(huán)境對(duì)原體系厭氧菌群和瘤胃微生物的代謝活動(dòng)及穩(wěn)定菌群關(guān)系的建立都具有積極影響.

2.3 底物降解特性

TS降解率是表征醋糟中被厭氧菌群利用干物質(zhì)量的重要指標(biāo).如圖4所示，P1～P6各運(yùn)行階段的TS降解率分別為51.2%、52.9%、54.1%、53.2%、54.9%和49.1%.TS降解率與體系單位質(zhì)量底物產(chǎn)氣情況變化趨勢(shì)一致.除P6階段外，其余5個(gè)階段TS降解率均呈逐漸升高趨勢(shì)，表明接種了瘤胃微生物的新厭氧消化體系逐漸穩(wěn)定，水解效能優(yōu)勢(shì)逐漸展現(xiàn).

圖4 各運(yùn)行階段TS和木質(zhì)纖維素降解率的變化Fig.4 TS and lignocellulose degradation efficiencies of each operation stage

木質(zhì)纖維素作為醋糟的主要成分，其降解效果對(duì)醋糟的厭氧消化性能有重要影響，所以將各階段半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解情況逐一分析，能進(jìn)一步解釋瘤胃微生物對(duì)木質(zhì)纖維素水解強(qiáng)化的效果.P1～P6各階段半纖維素降解率分別為68.1%、71.5%、73.6%、75.8%、73.9%和65.1%；相應(yīng)的纖維素降解率分別為42.3%、40.9%、39.8%、38.2%、40.1%和34.6%.木質(zhì)纖維素的降解效果幾乎全部由纖維素和半纖維素貢獻(xiàn)，纖維素和半纖維素的高降解率是底物高利用率的主要原因.結(jié)合水解微生物定量分析(見2.5節(jié))得出，木質(zhì)纖維素水解微生物的逐漸富集是木質(zhì)纖維素被高效利用的根本原因.其中，由于半纖維素分子量較小[26]、更容易被水解利用的特性，所以半纖維素的降解率更高，對(duì)木質(zhì)纖維素降解的貢獻(xiàn)更大.隨著有機(jī)負(fù)荷的提升，半纖維素降解率逐漸提高，在P4階段半纖維素降解率達(dá)到最高(75.75%).由于纖維素的高結(jié)晶度以及木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的物理屏障和無效吸附[27]，纖維素降解率顯著低于半纖維素降解率，且隨有機(jī)負(fù)荷的提升呈下降趨勢(shì).雖然木質(zhì)素被公認(rèn)為在厭氧環(huán)境下無法被利用[28]，但是有研究指出木質(zhì)素可以被瘤胃微生物少量降解[29-30].P1～P6各運(yùn)行階段，體系木質(zhì)素降解率分別為17.4%、16.3%、15.4%、18.1%、17.8%和12.4%，表明瘤胃微生物與原微生物體系可有效融合，并發(fā)揮其木質(zhì)纖維素水解功能.P6階段，纖維素和半纖維素的降解率均降低，這與VFAs濃度和單位質(zhì)量底物產(chǎn)氣降低結(jié)果(見2.1和2.2節(jié))相符.綜上，通過長期的連續(xù)運(yùn)行，瘤胃微生物展現(xiàn)出水解效能優(yōu)勢(shì)，成功塑造了高效的木質(zhì)纖維素瘤胃強(qiáng)化體系.

2.4 微生物定量解析瘤胃水解強(qiáng)化機(jī)制

在厭氧消化效能評(píng)估的基礎(chǔ)上深入探究生物強(qiáng)化過程中目標(biāo)微生物量的變化，對(duì)揭示瘤胃微生物強(qiáng)化的機(jī)理具有重要意義.定量檢測(cè)編碼木質(zhì)纖維素降解蛋白基因是研究體系水解情況的重要手段.在厭氧消化過程中，降解木質(zhì)纖維素的糖苷水解家族主要分布于GH5、GH9和GH48中，其中GH5水解家族分布最為廣泛，與木質(zhì)纖維素的降解效率呈正相關(guān)，瘤胃微生物如擬桿菌屬(Bacteroides)、梭菌屬(Clostridium)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)等都含有GH5基因[12].因此，該研究利用GH5水解酶基因表征厭氧消化過程中瘤胃強(qiáng)化體系中關(guān)鍵水解菌群的變化情況.

如圖5(a)所示，以陽性質(zhì)粒的基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)、Ct值為橫坐標(biāo)(X)，則水解家族GH5的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=11.313-0.237X，決定系數(shù)R2(coefficient of determination)為 0.996 55(>0.99).如圖5(b)所示，P1階段GH5基因拷貝數(shù)由最初的9.64×1010copies/g升至2.26×1011copies/g，然后持續(xù)降至最終的1.25×1011copies/g.這是因?yàn)榍捌诓粩嗉尤氲牡孜餅槲⑸锾峁┝舜罅繝I養(yǎng)物質(zhì)，水解微生物快速增殖；但又因一部分接種的瘤胃微生物無法適應(yīng)新的厭氧環(huán)境而從體系中消失[31].P1階段最終的基因拷貝數(shù)為最初拷貝數(shù)的1.30倍，說明部分來自瘤胃的微生物能適應(yīng)新的厭氧環(huán)境，并以一定的規(guī)模穩(wěn)定地存在于新的微生物體系中.P2階段初期，水解微生物因底物沖擊而短暫降至6.56×1010copies/g，然后逐漸升至9.64×1011copies/g.經(jīng)過長期連續(xù)運(yùn)行和底物刺激之后，P1～P6各運(yùn)行階段GH5水解家族的最終基因拷貝數(shù)不斷升高，分別為1.25×1011、2.06×1011、3.07×1011、5.32×1011、6.83×1011和4.66×1011copies/g，分別是初始GH5基因拷貝數(shù)的1.30、2.14、3.18、5.52、7.09和4.83倍.結(jié)合2.3節(jié)底物降解分析可以看出，P1～P5階段內(nèi)GH5大量富集，而底物降解率卻保持在相對(duì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，這是因?yàn)?，P1～P5階段物料停留時(shí)間由52 d降至34 d，意味著底物和微生物的接觸時(shí)間縮短，單位微生物在單位時(shí)間內(nèi)的底物降解量隨之減少.然而，GH5富集使得單位時(shí)間內(nèi)有更多的微生物參與底物降解，因而彌補(bǔ)了因物料停留時(shí)間縮短所導(dǎo)致的底物量降解量減少.高有機(jī)負(fù)荷下，木質(zhì)纖維素水解中間產(chǎn)物在低物料停留時(shí)間下無法被及時(shí)利用而逐漸富集，中間產(chǎn)物如纖維素低聚糖、琥珀酸等都是反饋抑制劑[32].因而，P6階段GH5水解菌群因受到抑制而無法繼續(xù)富集，GH5基因拷貝數(shù)由6.83×1011copies/g降至4.66×1011copies/g，低生物量和低物料停留時(shí)間的共同作用使得P6階段底物降解率顯著降低(見2.4節(jié)).底物降解效率的降低使得體系含固率升高，沼液黏性增加，弱化了體系的傳質(zhì)效果，導(dǎo)致體系底物降解效果進(jìn)一步降低.綜上，GH5水解微生物的富集是瘤胃強(qiáng)化體系底物處理能力提升和在低物料停留時(shí)間下底物被高效降解的根本原因.

圖5 GH5的標(biāo)準(zhǔn)曲線和厭氧消化過程中GH5的基因拷貝數(shù)變化Fig.5 Standard curve of GH5 and changes of GH5 gene copies during anaerobic digestion

3 結(jié)論

a) 通過接種瘤胃微生物強(qiáng)化木質(zhì)纖維素水解，醋糟厭氧發(fā)酵體系有機(jī)負(fù)荷升至8.90 g/(L·d)(以VS計(jì))，相應(yīng)的單位質(zhì)量底物沼氣和甲烷產(chǎn)量分別為451和261 mL/g(以VS計(jì))，相較于強(qiáng)化前其處理能力提升了1.53倍.這表明瘤胃微生物的介入可有效強(qiáng)化體系底物的降解能力，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)甲烷性能的提升.

b) 半纖維素和纖維素的高降解率是瘤胃強(qiáng)化體系單位質(zhì)量底物產(chǎn)氣提升的主要原因，最佳有機(jī)負(fù)荷〔8.90 g/(L·d)〕下，纖維素和半纖維素的降解率分別為73.9%、40.1%.這說明經(jīng)過連續(xù)的底物刺激，瘤胃微生物發(fā)揮出其木質(zhì)纖維素水解優(yōu)勢(shì)，成功塑造了高效的瘤胃水解強(qiáng)化體系.

c) 隨著有機(jī)負(fù)荷的提升，與木質(zhì)纖維素水解密切相關(guān)的瘤胃微生物逐漸適應(yīng)醋糟厭氧消化體系并持續(xù)富集，其基因拷貝數(shù)從9.64×1010copies/g升至最高有機(jī)負(fù)荷階段的6.83×1011copies/g，提高了6.09倍，這是醋糟厭氧消化體系通過瘤胃微生物強(qiáng)化后底物水解效率和厭氧消化效率顯著提升的根本原因.