林輝，孫必強(qiáng)，黃群

（1.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012；2.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院，湖南 株洲 412000）

0 引言

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis,DGP)為糖尿病常見慢性并發(fā)癥[1]，胃竇Cajal 間質(zhì)細(xì)胞 (interstitial cells of Cajal，ICC）作為胃腸道動(dòng)力的起搏細(xì)胞，能通過調(diào)節(jié)胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)的慢波，從而掌控胃腸道的自主節(jié)律運(yùn)動(dòng)。有研究表明[2]ICC 的數(shù)量減少、功能降低、超微結(jié)構(gòu)破壞等是導(dǎo)致糖尿病患者胃腸平滑肌正常收縮功能發(fā)生障礙的重要機(jī)制。基于ICC 已經(jīng)成為治療DGP 的重要靶點(diǎn)，本研究從ICC 表達(dá)和胃電節(jié)律角度，探索疏肝和胃丸治療DGP 的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

Wistar 大鼠150 只，60-80 日齡，體重（200±20）g，雄性，湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（許可證號(hào)：SYXK（湘）2011-0003），飼養(yǎng)溫度25℃，濕度50%，分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 藥物與試劑

多潘立酮片（10 mg/片，西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：H10910003）。注射用鏈脲佐菌素（Steptozotocin，STZ，美國Sigma 公司）；檸檬酸（天津市博迪化工有限公司）；兔抗c-kit 多克隆抗體(一抗)(武漢博士德生物公司)。

疏肝和胃丸中藥飲片由本校中藥教研室采購經(jīng)鑒定為真品，按每劑中加蒸餾水500 mL，煎煮40 分鐘，過濾，濃縮為浸膏，每克浸膏含生藥18.75 g，冷藏備用。

1.3 造模方法及分組

高糖高脂飼料喂養(yǎng)2 周，禁食不禁水12 h，編號(hào)后隨機(jī)抽取10 只為正常組，余為造模組。參照文獻(xiàn)[3]造模：造模組動(dòng)物在第1 天和第8 天分別兩次腹腔注射新鮮配制1%STZ 液，注射劑量為45 mg/kg，正常組大鼠相應(yīng)腹腔注射0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液，注射劑量為1 mL/只。第2 次STZ 注射后6w 尾尖采血測(cè)空腹血糖（Fasting Blood Glucose，F(xiàn)BG）。選取FBG＞16.7 mmol/L 同時(shí)伴有腹部脹大、體質(zhì)量減輕等胃輕癱癥狀動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、西藥組、疏肝和胃丸低、中、高劑量組，每組20 只。

1.4 給藥方法

西藥組每日按臨床劑量1 倍（0.5 mg/kg）給予多潘立酮灌胃，疏肝和胃丸低、中、高劑量組按臨床劑量1 倍（生藥1.5 g/kg）、2 倍（生藥3.0 g/kg）、4 倍（生藥6.0 g/kg）每日灌胃，給藥體積均為10 mL/kg，模型組與正常組予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥4 周。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.5.1 胃電節(jié)律的測(cè)定

大鼠禁食、禁水12 h，固定，采用10%烏拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉，腹部脫毛，75%酒精脫脂，采用美國MP150 型多導(dǎo)生理信號(hào)儀采集體表胃電描記。測(cè)定胃電慢波主頻率和主功率，描記30 min。

1.5.2 胃竇ICC 數(shù)量的檢測(cè)

取幽門附近胃竇組織約1.0 cm×1.0 cm，生理鹽水沖洗、4%多聚甲醛固定24 小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋、間斷連續(xù)切片、脫蠟、抗原修復(fù)。滴加c-Kit-抗體(按1:100 稀釋)，37 ℃恒溫箱孵育2 h，先后滴加生物素標(biāo)記的二抗和鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，恒溫箱孵育15 min，DAB 顯色2 min 左右。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察染色情況。陽性結(jié)果判斷：細(xì)胞胞漿染色呈棕褐色者判定為陽性表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠胃電節(jié)律與胃竇ICC 表達(dá)的比較

其他各組胃電主頻率、主功率均低于空白組，差異顯著（P＜0.01）；疏肝和胃丸各組胃電主頻率、主功率顯著高于模型組（P＜0.01），低于西藥組（P＜0.05），疏肝和胃丸各組胃竇ICC 表達(dá)顯著高于模型組（P＜0.01），低于西藥組（P＜0.05），詳見表1。

2.2 胃竇ICC 數(shù)量的檢測(cè)結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下可見：在胃竇組織肌層之間夾雜者形狀為圓形或邊緣不規(guī)則的細(xì)胞即為c-kit 陽性ICC 細(xì)胞。見圖1 所示，空白組c-kit 的ICC 陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量較多。圖2 示，與空白組比較，模型組大鼠c-kit 呈（+）的ICC 表達(dá)減少(P＜0.05）；與模型組比較，疏肝和胃丸高中低劑量組大鼠c-kit呈（+）的ICC 表達(dá)顯著增加(P＜0.05）。

表1 各組大鼠胃電節(jié)律與胃竇 ICC 表達(dá)的比較（±s）

表1 各組大鼠胃電節(jié)律與胃竇 ICC 表達(dá)的比較（±s）

注：a 與空白組比較P＜0.01；b 與模型組比較P＜0.01；c 與西藥組比較P＜0.05

圖1 空白組

圖2 模型組

圖3 高劑量組

圖4 中劑量組

圖5 低劑量組

圖6 西藥組

3 討論

DGP 的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，其中以ICC 為代表的組織學(xué)變化受到重視。ICC 數(shù)量的減少和形態(tài)結(jié)構(gòu)變化受多種因素調(diào)控，SCF/c-kit 信號(hào)通路在參與ICC 的增殖、分化以及表型維持等生理過程其中起著重要的作用[4]。當(dāng)c-kit 受體被SCF 活化后，c-kit 與SCF 結(jié)合，通過活化細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶及磷脂酰肌醇-3 激酶 (PI3K) 激活多個(gè)信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)[5]。電針[6]與中藥[7]均可通過促進(jìn)mSCF 蛋白表達(dá)，上調(diào)SCF/c-kit 信號(hào)通路，增加DGP 大鼠胃竇組織內(nèi)ICC 數(shù)量。

根據(jù)DGP 的臨床表現(xiàn)可歸于“胃痛”、“胃痞”、“嘔吐”范疇，病機(jī)上當(dāng)屬氣病，乃脾胃虛弱，肝氣橫逆克土，胃氣上逆所致。疏肝和胃丸是一臨床使用多年經(jīng)驗(yàn)方，具有疏肝和胃，降逆止嘔，行氣止痛之功，由柴胡、佛手、姜半夏、木香、柿蒂等八味中藥組成，臨床用于DGP 治療效果較好。前期實(shí)驗(yàn)研究顯示該方可通過增加胃粘膜血流量而具有較好的胃粘膜保護(hù)[8]及促胃腸動(dòng)力作用[9]。前期實(shí)驗(yàn)研究顯示該方促進(jìn)DGP 模型大鼠胃腸動(dòng)力可能與調(diào)節(jié)血清胃腸激素含量有關(guān)[10]。本研究顯示造模后，模型組動(dòng)物胃電節(jié)律與胃竇ICC 數(shù)量等指標(biāo)結(jié)果較空白組顯著降低（P＜0.01）。經(jīng)疏肝和胃丸治療后，以上指標(biāo)得到顯著提高（P＜0.01），提示疏肝和胃丸促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)胃竇組織SCF/c-kit信號(hào)通路，促進(jìn)ICC 的增殖、分化有關(guān)，其中的機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。