曹春月，陳前袆，王黔陽，何 珺**

（1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025）

前 言

銀杏葉（Ginkgo biloba L.）主產(chǎn)于中國，我國銀杏資源占世界總量的80%。目前我國銀杏葉年產(chǎn)約為1 萬噸以上，年產(chǎn)銀杏葉提取物約為620 噸，銀杏產(chǎn)業(yè)年總產(chǎn)值280 多億元，國內(nèi)銀杏葉制劑年產(chǎn)值約為 70 億元[1]。

銀杏葉中主要有黃酮類、萜內(nèi)酯類、有機酸類、聚異戊烯醇類、多糖類等活性成分[2～4]。但對其黃酮類、內(nèi)酯類成分的研究開發(fā)較多，而對其中的其他成分活性研發(fā)較少。黃酮類具有多種功能，比如抗氧化、清除自由基、抗衰老等[5～6]；內(nèi)酯類化合物具有降血脂、保護(hù)神經(jīng)等藥理活性；莽草酸具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性，同時是達(dá)菲藥物的重要成分，市場需求量很大[7]；綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化作用、降血壓和降血脂等功能，在食品上作為一些果汁的護(hù)色劑以及水果保鮮作用[8～11]。目前，莽草酸有少量專利報道，綠原酸的提取大部分在金銀花以及杜仲這兩種產(chǎn)物上，而在銀杏葉中從未有過研究。本文主要對銀杏葉中總黃酮、總內(nèi)酯、莽草酸以及綠原酸4 種活性成分進(jìn)行綜合提取，采用了正交試驗對提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究，為銀杏葉綜合利用提供參考數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（Agilent1260，美國）；紫外可見分光光度計（UV757CRT，上海佑科儀器儀表有限公司）；超聲波清洗器（KQ3200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；電子分析天平（BT25S，塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

銀杏葉于2016 年9 月采摘自江蘇省邳州市，具有5 年樹齡。莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號18071724，上海同田生物技術(shù)股份有限公司）、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號09081633，上海同田生物技術(shù)股份有限公司）、銀杏內(nèi)酯A（10011506，中國食品藥品檢定研究院）、銀杏內(nèi)酯B（110863-200508，中國食品藥品檢定研究院）、銀杏內(nèi)酯C（09102111，中國食品藥品檢定研究院）、白果內(nèi)酯（09082711，中國食品藥品檢定研究院）、槲皮素（110862-201510，中國食品藥品檢定研究院）、山柰素（110861-201310，中國食品藥品檢定研究院）、異鼠李素（110860-201410，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇為色譜純；水為純水；其他試劑為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏葉前處理

將銀杏葉用60℃烘干，粉碎后裝袋備用。

1.2.2 提取液的制備

分別精密稱取約2g 銀杏葉粉末，按照表1 提取溫度、提取時間、料液比以及乙醇濃度4 個因素，進(jìn)行提取實驗，通過漏斗過濾即得，記錄提取液體積V。

表1 因素水平表（n=3）Table 1 The factors and levels（n=3）

1.2.3 黃酮、內(nèi)酯、綠原酸、莽草酸含量測定

1.2.3.1 對照品溶液的制備

總黃酮對照品溶液制備 精密稱定三種對照品：槲皮素48.2mg、山柰素69.5mg、異鼠李素60.1mg，放置于100mL 容量瓶中，然后加入甲醇溶解后定容至刻度，得槲皮素、山柰素、異鼠李素濃度分別為482、695、601μg·mL-1的混合總黃酮對照品溶液。

總內(nèi)酯對照品溶液制備 精密稱定四種對照品：銀杏內(nèi)酯A132.1mg、銀杏內(nèi)酯B26.6mg、銀杏內(nèi)酯C51.7mg、白果內(nèi)酯156.2mg，放置于100mL 容量瓶中，然后加入甲醇溶解后定容至刻度，得到的銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯濃度分別為 1321、266、517、1562μg·mL-1的混合總內(nèi)酯對照品溶液。

綠原酸對照品溶液制備 精密稱定綠原酸對照品21.2mg，放置于100mL 容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，配置成0.212mg·mL-1綠原酸對照品溶液。

莽草酸對照品制備 精密稱定莽草酸對照品105.3mg，放置于100mL 容量瓶中，加30%甲醇溶解并定容至刻度，配置成0.1053mg·mL-1莽草酸對照品溶液。

1.2.3.2 供試品溶液的制備

總黃酮供試品制備 取銀杏葉正交提取樣液1mL 置于10mL 具塞管中，加4mL 液體水解液（甲醇∶純水∶鹽酸=7∶2∶1），放置于68℃水浴鍋中，3h 后取出放置冷卻于室溫下，用0.45μm 濾膜過濾，得總黃酮供試品溶液。

總內(nèi)酯供試品制備：取適量銀杏葉提取液用Al2O3過濾，得總內(nèi)酯供試品溶液。

莽草酸供試品制備：取適量銀杏葉提取液用0.45μm 濾膜過濾，得莽草酸供試品溶液。

綠原酸供試品制備：取適量銀杏葉提取液用0.45μm 濾膜過濾，得莽草酸供試品溶液。

1.2.3.3 HPLC 測定色譜條件

莽草酸色譜條件：Inertsil 氨基柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈 -0.1%磷酸（15∶85），流速為 1mL·min-1，波長為 213nm，進(jìn)樣量 10μL，柱溫25℃。

總黃酮色譜條件：C18 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-0.4%磷酸水（50∶50），流速為 1mL·min-1，波長為 360nm，進(jìn)樣量 10μL，柱溫50℃。

總內(nèi)酯色譜條件：采用C18 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇 - 水（28∶72），流速為 1mL·min-1，波長為 360nm，進(jìn)樣量 10μL，柱溫50℃。

綠原酸色譜條件：采用C18 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈-0.2%磷酸水（11∶89），流速為0.8mL·min-1，波長為324nm，進(jìn)樣量10μL，柱溫 35℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 綜合評分的計算

綜合評分=總黃酮含量評分＋萜類內(nèi)酯含量評分＋綠原酸含量評分+莽草酸含量評分；總黃酮含量評分=（總黃酮含量/ 最大總黃酮含量）×100×0.25；萜類內(nèi)酯含量評分= （萜類內(nèi)酯含量/最大萜類內(nèi)酯含量）×100×0.25；莽草酸含量評分=（莽草酸含量/最大莽草酸含量）×100×0.25；綠原酸含量評分=（綠原酸含量/最大綠原酸含量）×100×0.25。

2.2 提取正交試驗結(jié)果

2.2.1 莽草酸正交試驗結(jié)果

表2 正交試驗數(shù)據(jù)與結(jié)果Table 2 The orthogonal test data and results

從該莽草酸正交試驗結(jié)果中，可以看出：影響銀杏葉莽草酸含量的因素主次為D＞B＞C＞A，也就是料液比的影響最高，其余依次為提取溫度、醇濃度，影響最小的為提取時間。并且由k 值比較可以知道，在料液比的比較中，k3＞k2＞k1，所以料液比為1∶15 為最優(yōu)。同理，可以分析得出最優(yōu)工藝為A3B1C3D3，即提取時間3h、提取溫度50℃、料液比1∶15、醇濃度 70%。

2.2.2 總黃酮正交試驗結(jié)果

表3 正交試驗數(shù)據(jù)與結(jié)果Table 3 The orthogonal test data and results

從該總黃酮正交試驗結(jié)果中，可以看出：影響銀杏葉總黃酮含量的因素主次為D＞C＞A＞B，即料液比的影響最高，其余依次為醇濃度、提取時間，影響最小的為提取溫度。并且由k 值比較可以知道，在溫度的比較中，k2＞k1＞k3，所以提取溫度60℃為最優(yōu)。同理，可以分析得出最優(yōu)工藝為A3B2C3D3，即提取時間3h、提取溫度60℃、料液比1∶15、醇濃度70%。

2.2.3 總內(nèi)酯正交試驗結(jié)果

表4 正交試驗數(shù)據(jù)與結(jié)果Table 4 The orthogonal test data and results

從該總黃酮正交試驗結(jié)果中，可以看出：影響銀杏葉總內(nèi)酯含量的因素主次為D＞B＞A=C，即料液比的影響最高，其余為提取溫度、提取時間和醇濃度影響一樣。并且由k 值比較可以知道，在提取時間的比較中，k2＞k3＞k1，所以提取時間 2h 為最優(yōu)。同理，正交試驗中可以分析得出最優(yōu)工藝為A2B1C2D3，即提取時間2h、提取溫度50℃、料液比1∶15、醇濃度50%。

2.2.4 綠原酸正交試驗結(jié)果

表5 正交試驗數(shù)據(jù)與結(jié)果Table 5 The orthogonal test data and results

從該綠原酸正交試驗結(jié)果中，可以看出：影響銀杏葉綠原酸含量的因素主次為D＞C＞B＞A，即料液比的影響最高，其余為醇濃度、提取溫度、提取時間。并且由k 值比較可以知道，在醇濃度的比較中，k3＞k2＞k1，所以醇濃度為70%為最優(yōu)。同理，正交試驗中可以分析得出最優(yōu)工藝為A1B1C3D2，即提取時間1h、提取溫度50℃、料液比1∶10、醇濃度70%。

2.3 4 種活性成分提取正交試驗綜合評分表

表6 綜合評分表Table 6 The comprehensive score sheet

通過表6 和表7 可以明顯看出，影響因素順序依次為D 料液比＞C 乙醇濃度＞B 提取溫度＞A 提取時間，其中，因素D 的改變對提取效果具有顯著影響。每個水平對該試驗結(jié)果的影響大小依次為A2＞A3＞A1，B1＞B2＞B3，C3＞C2＞C1，D3＞D2＞D1。從極差分析以及方差分析得出的結(jié)果綜合考慮，得到銀杏葉最佳提取工藝：A2B1C3D3。即提取時間2h，提取溫度為50℃，料液比為1∶15，乙醇濃度為70%。

2.4 驗證試驗

稱取銀杏葉3 份，按照優(yōu)選提取工藝A2B1C3D3條件進(jìn)行提取后，可以得到綠原酸、莽草酸、總黃酮以及內(nèi)酯的含量，從而計算出評分，從表8 中可以看到綜合評分平均達(dá)95.48 分以上，表明該工藝穩(wěn)定、可行，可用于銀杏葉中4 種活性成分的綜合提取。

表8 驗證試驗Table 8 The verification test

3 結(jié) 論

采用正交試驗法優(yōu)化銀杏葉中莽草酸、總黃酮、總內(nèi)酯、綠原酸4 種活性成分的提取工藝，通過比較，最終的優(yōu)化方案為：料液比1∶15、醇濃度70%、提取時間2h、提取溫度50℃。這樣的優(yōu)化方案最大的優(yōu)點在于能夠同時有效地將銀杏葉中莽草酸、綠原酸、總內(nèi)酯、總黃酮最大程度的提取出來，為銀杏葉中這4 種活性成分的綜合利用工藝提供一定的參考價值，對提高銀杏葉的綜合利用是很有意義的。