黃美盈，袁耿彪，潘東風，何雨蓓，李倩茹

重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院核醫(yī)學科，重慶 400010； *通訊作者 袁耿彪 yuan_gb@126.com

腫瘤是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，近年發(fā)病率呈逐年增長的趨勢。各種現(xiàn)代成像技術廣泛應用于監(jiān)測腫瘤組織的結構、功能和分子變化，包括光學成像（通過生物發(fā)光或熒光）、CT、MRI、PET、SPECT及超聲[1]。每種成像方法均有其獨特的強度和內(nèi)在的局限性，使得在疾病部位獲得精確可靠的信息變得困難[2]。多模態(tài)分子成像結合2 種或以上的檢測技術，形成一種新的成像方法，便于在診斷、治療、監(jiān)測等方面獲得進一步的信息。目前，多模態(tài)分子成像已廣泛應用于醫(yī)學研究和臨床實踐的優(yōu)化，對心血管疾病、神經(jīng)精神疾病[3]和其他臨床疾病[4]均有幫助；還能顯著提高腫瘤邊界的定位，有效指導腫瘤的手術切除[5]。

由于近紅外熒光成像在生物成像方面仍存在一定的缺點，如組織滲透性較低，在癌癥的臨床應用中僅適合淺表部位腫瘤的顯像，故本實驗選用乳腺癌鼠瘤模型。本研究將近紅外熒光染料MHI 148、螯合劑1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二-1，4，7，10-四乙酸（1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic acid，DOTA）與放射性核素177Lu 結合，形成多模態(tài)分子探針177Lu-DOTA-MHI 148，將探針注入荷乳腺癌裸鼠體內(nèi)，同時采用近紅外成像與γ 閃爍成像提高對腫瘤的診斷效率。本實驗擬采用177Lu標記DOTA-MHI 148，并對標記物在乳腺癌MCF-7裸鼠體內(nèi)生物分布及活體成像進行研究，為進一步實現(xiàn)177Lu-DOTA-MHI 148 對腫瘤的診療一體化提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 近紅外熒光染料DOTA-MHI 148（弗吉尼亞大學放射醫(yī)學系惠贈）；人乳腺癌細胞系MCF-7 細胞株（重慶醫(yī)科超聲研究所）；177Lu 核素（西南醫(yī)科大學核醫(yī)學科）；裸鼠（重慶醫(yī)科大學實驗動物中心），本研究符合重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院實驗動物倫理委員會制訂的倫理學標準；鹽酸、醋酸鈉（成都科龍化工試劑廠）；CRC-15R 活度計（美國Capintee 公司）；SPECT 顯像儀（美國GE 公司）；SN-695B 型智能放免γ 計數(shù)器（上海物理研究所日環(huán)光電儀器有限公司）。

1.2177Lu-DOTA-MHI 148 的制備及標記率的測定取DOTA-MHI 148 20 μg溶于10%乙醇溶液（1 mg/ml）放入EP 管中，將177LuCl32 mCi 和0.25 mol/L 醋酸鈉溶液加入上述溶液中，調(diào)整酸堿比為3∶1，于90℃下反應30 min。采用高效液相分析法（HPLC）測定177Lu-DOTA-MHI 148 標記率。HPLC 色譜條件：C18 色譜柱；紫外檢測器，波長220 nm；流速1 ml/min；溶劑A 為0.1% TFA 的乙腈溶液，溶劑B 為0.1% TFA 的水溶液采用梯度洗脫：0～20 min 5%～85%溶劑A，20～25 min 85%～5%溶劑A。

1.3 構建裸鼠乳腺癌動物模型 將人乳腺癌細胞MCF-7 用RPMI 1640 細胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素雙抗）在37℃、5% CO2及常規(guī)濕度條件下培養(yǎng)，待細胞處于對數(shù)生長期時，用胰蛋白酶消化1 min，調(diào)整細胞數(shù)量至2.5×107/ml。選取18 只4 周齡左右的雌性裸鼠，將0.1 ml 細胞懸液接種至雌性裸鼠右側大腿皮下。待腫瘤長至大于1.0～2.0 cm3時備用。

1.4177Lu-DOTA-MHI 148 在MCF-7 乳腺癌細胞荷瘤裸鼠的生物分布 選取12 只荷瘤裸鼠，隨機分成3 組，每組4 只。尾靜脈注射100 μl177Lu-DOTA-MHI 148（0.1 mCi），分別于注射12、24、48 h 后處死3 組裸鼠，取心臟、肝、脾、肺、腎、胃、腸、股骨、腫瘤、血液、左側大腿肌肉等組織器官，用天平準確稱量器官重量，用γ計數(shù)器檢測各個器官的放射性計數(shù)。然后根據(jù)公式（1）計算各組織每克組織的百分注射劑量率（%ID/g）。

1.5177Lu-DOTA-MHI 148 在MCF-7 荷瘤鼠體內(nèi)的γ閃爍成像 按照上述標記條件標記177Lu-DOTA-MHI 148 備用。選取3 只已空腹6 h 的荷瘤鼠，準備3 支一次性無菌注射器，每支注射器取0.1 ml177Lu-DOTA-MHI 148（0.3 mCi），在注射放射性藥物8、24、48 h 后，將裸鼠俯臥位固定于泡沫板上，進行SPECT 靜態(tài)顯像，每個時間點連續(xù)采集10 min，并觀察177Lu-DOTA-MHI 148 在裸鼠體內(nèi)的放射性濃聚隨時間的變化情況。采用針孔準直器SPECT 顯像儀進行圖像采集，主能峰為208 keV，副能峰為113 keV，矩陣128×128，放大倍數(shù)為3 倍。

1.6 裸鼠活體近紅外熒光成像 取3 只接種成功的裸鼠，準備3 支一次性無菌注射器，每支注射器取177Lu-DOTA-MHI 148 100 μl，注射放射性藥物1、6、24、48、72 h 后進行活體熒光成像。激發(fā)光/發(fā)射光為740 nm/820 nm。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 軟件，計量資料以±s表示，采用配對t檢驗進行比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1177Lu-DOTA-MHI 148 的標記率及穩(wěn)定性 以90℃、pH 5～6、DOTA-MHI 148 20 μg、177LuCl32 mCi為制備條件，新鮮制備177Lu-DOTA-MHI 148（圖1），測得其1 h 時標記率為（97.83±0.62）%（圖2）。在室溫25～27℃條件下，放置24 h 后，標記物的標記率略微降低，為（95.75±0.56）%，仍高于95%（圖3），1 h 與24 h 穩(wěn)定性差異有統(tǒng)計學意義（P=0.012），177Lu-DOTA-MHI 148 在室溫條件下具有較好的體外穩(wěn)定性。

2.2177Lu-DOTA-MHI 148 荷MCF-7 裸鼠體內(nèi)的生物分布177Lu-DOTA-MHI 148 在荷MCF-7 裸鼠體內(nèi)主要分布于腫瘤、血液、心、肝、腎等組織，隨著注射藥物后時間的增加，血液、心、肝、腎的%ID/g 逐漸降低，腫瘤的%ID/g 隨著注射藥物時間的增加而逐漸增加，表明177Lu-DOTA-MHI 148 在腫瘤組織中有較長的滯留時間，并且在48 h 時，腫瘤內(nèi)標記物分布達到最大，且腫瘤/肌肉比值達到最高，為40.53±16.09（表1）。

圖1 177Lu-DOTA-MHI 148 的分子結構式

圖2 1 h 時177Lu-DOTA-MHI 148 的HPLC 圖譜

圖3 室溫放置24 h 后，177Lu-DOTA-MHI 148 的HPLC 圖譜

表1 177Lu-DOTA-MHI 148 在荷人乳腺癌裸鼠體內(nèi)的生物分布（%ID/g，±s，n＝4）

表1 177Lu-DOTA-MHI 148 在荷人乳腺癌裸鼠體內(nèi)的生物分布（%ID/g，±s，n＝4）

部位12 h 24 h 48 h心臟 1.64±1.23 0.93±0.27 0.78±0.12肝1.85±0.15 1.28±0.41 0.89±0.33脾 0.33±0.05 0.22±0.08 0.17±0.06肺0.57±0.05 0.36±0.11 0.20±0.08腎 2.65±0.86 1.07±0.25 0.46±0.22胃0.41±0.31 0.23±0.11 0.14±0.06骨骼 0.41±0.18 0.28±0.09 0.24±0.04肌肉0.23±0.04 0.16±0.04 0.11±0.03結腸 0.29±0.04 0.23±0.10 0.16±0.07血液3.16±1.87 2.09±0.77 1.01±0.13腫瘤 0.94±0.17 1.68±0.62 4.69±2.28腫瘤/肌肉比4.18±1.55 12.73±8.60 40.53±16.09

2.3177Lu-DOTA-MHI 148 在荷MCF-7 裸鼠體內(nèi)的γ閃爍成像 注射放射性藥物177Lu-DOTA-MHI 148 后，顯像圖示，隨著時間增加，腫瘤逐漸放射性濃聚增加，而其他各器官放射性分布逐漸減退，在48 h 時腫瘤顯像顯示荷瘤裸鼠的腫瘤部位有較高濃度的放射性攝?。▓D4）。

2.4177Lu-DOTA-MHI 148 在荷MCF-7 裸鼠體內(nèi)的近紅外熒光成像 荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射177Lu-DOTA-MHI 148 1 h 后，肝臟、心臟部位即刻顯影。腫瘤顯影較弱。隨著時間的推移，腫瘤部位熒光逐漸增強，腫瘤周背景熒光相對減弱，48 h 時腫瘤顯影效果最佳，并延續(xù)至72 h。使用儀器自帶軟件測量發(fā)現(xiàn)整個成像過程中腫瘤部位的熒光強度始終高于正常部位的熒光強度（圖5）。

圖4 荷人乳腺癌裸鼠注射177Lu-DOTA-MHI 148（0.3 mCi）后，分別于8 h（A）、24 h（B）、48 h（C）進行γ 閃爍成像，顯示腫瘤位置（箭）

圖5 荷人乳腺癌裸鼠注射177Lu-DOTA-MHI 148 后分別在1、6、24、48、72 h（A～E）的近紅外熒光顯像情況及腫瘤與對照部位熒光強度測量值，腫瘤熒光信號明顯強于周圍皮膚

3 討論

近紅外熒光成像的發(fā)射波長為600～900 nm，在此波長范圍內(nèi)吸收近紅外光的物質(zhì)少，在傳播過程中受到的干擾很小。同時近紅外成像具有高信噪比、高靈敏度、高分辨率、低成本、無創(chuàng)傷性、生物相容性好等優(yōu)勢[6-7]。近紅外熒光七甲川花菁染料，如IR-780、IR-783 和MHI 148 等，具有親脂性，不需要化學修飾，不需要與腫瘤特異性分子連接，自身即可高效蓄積在腫瘤細胞中，可被多種腫瘤細胞攝取，而在正常細胞內(nèi)攝取較少或無攝取，其進入生物體后，可聚集在腫瘤組織，且近紅外熒光信號可保持較長時間，而不聚集或僅少量聚集在正常組織中[8]。

Zhang 等[9]研究證實此類近紅外熒光吲哚七甲川菁染料能在腫瘤細胞線粒體中蓄積，與腫瘤細胞中的有機陰離子轉運肽及缺氧誘導因子1α 有關。SLCO 基因編碼的有機陰離子轉運多肽是介導多種臨床藥物和內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)跨膜轉運的重要轉運蛋白超家族[10]。HIF1 族經(jīng)常在多種類型的腫瘤中表達，并且通常與不良預后和快速表達疾病表型的預后相關。

既往已有研究將近紅外熒光七甲川花菁染料MHI 148與螯合劑DOTA結合形成DOTA-MHI 148，將其命名為探針PC-1001，用放射性核素64Cu 標記探針PC-1001 構成64Cu-PC-1001，有效實現(xiàn)了乳腺癌近紅外熒光與正電子發(fā)射斷層顯像[11]。后來又將近紅外熒光七甲川花菁染料MHI 148 與聯(lián)肼尼克酰胺相連，命名為PZ-1009。再與99Tcm結合，做成探針99Tcm-PZ-1009[11]，有效實現(xiàn)了關于近紅外熒光與單光子發(fā)射斷層顯像雙模式成像的研究。

本實驗選用放射性核素177Lu，是較為理想的醫(yī)用放射性核素。與其他核素相比，177Lu 具有以下優(yōu)點：①衰期較長（6.647 d），可供遠距離運輸，以及允許復雜的程序合成和純化放射性藥物；②177Lu 通過反應堆大規(guī)模生產(chǎn)，易于獲得，價格低廉，比活度高；③可以發(fā)射出能量為112.95 keV（6.40%）、208 keV（11.00%）、321.3 keV（0.219%）、249.7 keV（0.212%）、和71.65 keV（0.15%）的γ 射線，可通過使用傳統(tǒng)SPECT 顯像，可對病灶進行定位和測量，便于觀察患者體內(nèi)放射性藥物分布情況；④177Lu 能發(fā)射3 種能量分別為498 keV（79.3%）、380 keV（9.1%）和176 keV（12.2%）的β 粒子，用于腫瘤的治療[12]。β 粒子的能量射程短，能夠在對腫瘤組織進行治療的同時減少正常組織損傷，并且對骨髓的抑制作用較輕。

然而，放射性核素探針也有其缺點，如空間分辨率低、暴露于輻射下、基礎代謝率高的組織（如大腦）大量攝取。由于七甲川花菁近紅外熒光小分子MHI 148 為親脂性陽離子化合物，不需要與另外的化學基團連接，可直接被腫瘤攝取，在癌細胞中特別積聚，并可通過近紅外熒光成像對腫瘤進行影像診斷。因為放射性核素成像比近紅外熒光成像具有更好的組織滲透性，核素成像和光學成像是提高熒光在生物組織中穿透深度的一種有吸引力的組合[13-14]。這種組合的造影劑不僅在成像中提供了詳細的空間分辨率，而且提高了腫瘤的診斷水平。

七甲川菁類染料MHI-148 具有良好的腫瘤聚集特性和較高的量子產(chǎn)率，在正常組織中顯示低攝取/滯留，代表一種新的腫瘤成像探針[15]。這些染料通過與放射性核素結合進一步修飾，放射性同位素標記染料不僅可以解決常規(guī)近紅外熒光染料滲透性差的問題，實現(xiàn)無創(chuàng)成像，并且可以用于確定腫瘤的發(fā)生程度。近紅外光譜結合放射性同位素顯像可以為腫瘤的早期診斷提供新的方法。

本研究發(fā)現(xiàn)177Lu-DOTA-MHI 148 對乳腺癌具有良好的靶向作用。將該分子探針注入荷瘤裸鼠體內(nèi)48 h 后，在近紅外熒光成像與γ 閃爍成像中，腫瘤顯像清晰，并且腫瘤可在177Lu-DOTA-MHI 148 注射后較長時間仍能清晰顯示。此外，體內(nèi)生物分布的實驗結果顯示隨著注射時間的增加，腫瘤中177Lu-DOTA-MHI 148 的攝取逐漸增加，而其他正常組織中177Lu-DOTA-MHI 148 的攝取隨著時間的增加而減少，并且在48 h 時177Lu-DOTA-MHI 148 在腫瘤中的攝取高于其他正常器官組織。該化合物能迅速從血液中清除，并通過腎臟排泄。

本研究的局限性：①MHI 148 進入腫瘤細胞的具體機制目前不清楚，有待進一步研究；②盡管該藥物在腫瘤中攝取較高，但仍有一部分在腎、肝、心臟代謝器官中攝取，其攝取的特異性有待進一步提高；③本實驗對放射性核素177Lu 的治療作用未進一步研究，該多模態(tài)分子探針177Lu-DOTA-MHI 148 的診療一體化作用尚有待通過進一步的實驗進行驗證。