□ 萬(wàn)宇平 何方洋 賈芳芳 崔娜 崔海峰 北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心
□ 鄭百芹(通信作者) 唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心
滴滴涕(dichlorodiphenyltrichloroethane,簡(jiǎn)稱(chēng)“DDT”)是一種高毒有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑,其應(yīng)用廣泛,因?qū)οx(chóng)有觸殺、胃毒等作用而被用于防治蚊蠅和臭蟲(chóng)[1-3]。由于該藥物化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定,容易富集污染環(huán)境,并可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體而危害健康。因此,早在2009年,我國(guó)就已全面禁止了滴滴涕的生產(chǎn)、使用和進(jìn)出口。但時(shí)至今日,仍有部分養(yǎng)殖戶(hù)使用滴滴涕作為殺蟲(chóng)劑,故對(duì)該農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)具有必要性[4-6]。
目前,檢測(cè)滴滴涕的方法大多為儀器方法[7-14],但此類(lèi)方法成本較高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜,不符合基層實(shí)驗(yàn)室高效、便捷的檢測(cè)要求。因此,本研究制備出一種滴滴涕的單克隆抗體,將其應(yīng)用于膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條,可實(shí)現(xiàn)高效、便捷的檢測(cè)。
滴滴涕、五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%),購(gòu)自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心;檸檬酸三鈉、碳酸鉀,購(gòu)自北京百欣試劑公司;樣本提取劑、樣本復(fù)溶液、膠體金分析儀,由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供;渦旋儀、均質(zhì)器,購(gòu)自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司[15-16]。
圖1 滴滴涕半抗原合成
1.2.1 滴滴涕半抗原的制備
取1.7g鄰氯苯乙酸,加5mL氯苯,再加入1.8g水合氯醛,加熱至完全溶解后,加入三氯化鋁5.38g,室溫?cái)嚢?h,停止反應(yīng),加水80mL和乙酸乙酯120mL,萃取分離,分去水相,有機(jī)相無(wú)水硫酸鈉干燥蒸干,得到黃色油狀物,上硅膠柱,石油醚/乙酸乙酯(v/v,1/1)洗脫分離,得到乙酸滴滴涕半抗原產(chǎn)物1.8g,收率43.9%。
1.2.2 免疫原的制備—滴滴涕半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物合成
取乙酸滴滴涕半抗原產(chǎn)物15mg,加DMF1mL,溶解澄清,加EDC13.7mg和NHS10.9mg,充分混勻后,反應(yīng)4h,得到半抗原活化液A液;取牛血清白蛋白(BSA)50mg,加0.05M PB溶解,得到B液。將A液滴加到B液中,4℃反應(yīng)24h后0.02M PBS透析純化3天,每天換液3次,得到滴滴涕-BSA偶聯(lián)物,即免疫原,分裝后于-20℃保存。
圖2 滴滴涕膠體金試紙條結(jié)果判定示意圖
1.2.3 免疫原的制備—滴滴涕半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)物合成
取乙酸滴滴涕半抗原產(chǎn)物9mg,加DMF1mL,溶解澄清,加EDC7.6mg和NHS6.8mg,充分混勻后反應(yīng)4h,得到半抗原活化液A液;取卵清白蛋白(OVA)50mg,加 0.05M PB溶解,得到 B液。將A液滴加到B液中,4℃反應(yīng)24h后0.02M PBS透析純化3天,每天換液3次,得到滴滴涕-OVA偶聯(lián)物,即免疫原,分裝后于-20℃保存。
1.2.4 將滴滴涕單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上
將滴滴涕單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物加入到微孔板中,冷凍干燥,得到滴滴涕單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干的微孔試劑[15-16]。
1.2.5 檢測(cè)方法
向微孔中加入100μL待檢樣本溶液,混勻,室溫下培育3min。吸取70μL溶液滴至試紙條上,反應(yīng)10min,根據(jù)示意圖判定結(jié)果或通過(guò)膠體金分析儀讀取檢測(cè)結(jié)果[15-16]。
1.2.6 樣本檢測(cè)限
在空白蔬菜、水果、飼料、牛奶樣本中分別添加滴滴涕標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、4、4.5、5、5.5、6μg/L,按照“1.2.5”所述方法用3批試紙條進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)濃度重復(fù)5次,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測(cè)限[15-16]。
1.2.7 試紙條的特異性
分別配制500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等藥物,用膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè),重復(fù)測(cè)定3次,判斷試紙條的特異性[15-16]。
1.2.8 準(zhǔn)確性
農(nóng)業(yè)部文件要求:以假陽(yáng)性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準(zhǔn)確性[15-16]。取經(jīng)過(guò)儀器確證的50份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品(質(zhì)量濃度小于5μg/kg)與50份陽(yáng)性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品(質(zhì)量濃度大于5μg/kg),用膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)滴滴涕的殘留量,計(jì)算假陽(yáng)性率和假陰性率[15-16]?!掇r(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》規(guī)定:試紙條假陽(yáng)性率應(yīng)小于5%,假陰性率應(yīng)為零[15-16]。
表1 滴滴涕快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限
表2 特異性測(cè)定
1.2.9 試紙條的穩(wěn)定性
將試紙條保存于2~8℃環(huán)境中,每隔1個(gè)月檢測(cè)試紙條的準(zhǔn)確性,連續(xù)測(cè)定15個(gè)月[15-16]。具體方法為:分別檢測(cè)經(jīng)過(guò)儀器確證的20份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品(質(zhì)量濃度小于5μg/kg)與20份陽(yáng)性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品(質(zhì)量濃度大于5μg/kg),重復(fù)測(cè)定2次,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性[15-16]。
配置滴滴涕濃度分別為0、4、4.5、5、5.5、6μg/L的蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品,按照“1.2.5”步驟進(jìn)行檢測(cè),確定檢測(cè)限[15-16]。結(jié)果顯示,該試紙條的檢測(cè)限為5μg/kg,見(jiàn)表1。
用試紙條檢測(cè)500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等藥物,結(jié)果均呈陰性(見(jiàn)表2),表明該試紙條特異性較好[15-16]。
用試紙條檢測(cè)50份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品,檢測(cè)結(jié)果均為陰性,說(shuō)明假陽(yáng)性率低于5%;用試紙條檢測(cè)50份陽(yáng)性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品,檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性(見(jiàn)表3),說(shuō)明該試紙條假陰性率為零,符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求[15-16]。
表3 準(zhǔn)確性測(cè)定
試紙條保存12個(gè)月內(nèi),其假陽(yáng)性率和假陰性率的檢測(cè)結(jié)果均符合要求;之后試紙條會(huì)出現(xiàn)少量失效、假陰性等現(xiàn)象[15-16](見(jiàn)表4)。
目前,有關(guān)檢測(cè)滴滴涕的文獻(xiàn)較為有限,本研究通過(guò)制備滴滴涕半抗原,讓其與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原,最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求,對(duì)試紙條進(jìn)行了特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等性能測(cè)試,均符合要求。此外,該試紙條的檢測(cè)時(shí)間僅為15min,比現(xiàn)有文獻(xiàn)中儀器方法用時(shí)更短,操作更簡(jiǎn)便。