倪建騰，馬致潔，章從恩，趙奎君(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥劑科，北京 100050)

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種非發(fā)酵陰性不動(dòng)桿菌，近年來已成為我國醫(yī)院現(xiàn)存的主要條件致病菌[1];其耐藥性強(qiáng)，傳播途徑廣[2];臨床主要采用抗菌藥物治療[3]。由本課題前期分析“2016上半年鮑曼不動(dòng)桿菌感染的臨床用藥情況”的結(jié)論可知，抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用手段在治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染方面并沒有絕對的優(yōu)勢，抗菌藥物耐藥問題依然嚴(yán)峻。因此，尋找新思路、新途徑來抑制鮑曼不動(dòng)桿菌是臨床急需解決的難題。如果某藥能在相同的藥效水平下減少抗菌藥物的用量，就會(huì)降低抗菌藥物致使鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)，從而降低鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率。

課題組前期對臨床治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染頗有功效的中藥復(fù)方進(jìn)行了用藥分析，結(jié)果顯示，黃芩的用藥頻率為5.15%，居首位；而黃連的用藥頻率為4.44%，居其次。黃連來源于毛茛科植物黃連、三角葉黃連或云連，上述植物根莖富含多種異喹啉類生物堿。翟華強(qiáng)等[4]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確認(rèn)黃連外用具有明顯的抗炎作用。李立津等[5]和楊春梅等[6]報(bào)道了小檗堿具有消除細(xì)菌的耐藥質(zhì)粒的能力，可以降低細(xì)菌對藥物的耐藥性。黃芩來源于唇形科植物黃芩的根，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，現(xiàn)代研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)和皂苷類物質(zhì)是黃芩發(fā)揮生物活性的主要成分，具有抗菌、抗病毒及體外抑菌作用[7-9]。因此，黃連、黃芩在抑制鮑曼不動(dòng)桿菌或優(yōu)化抗菌藥物應(yīng)用等領(lǐng)域具有很大潛力。

鑒于臨床中藥復(fù)方多選用水煎法服用，故本研究旨在觀察黃連、黃芩水提物與替加環(huán)素聯(lián)合體外抑制鮑曼不動(dòng)桿菌的作用，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察黃芩苷、鹽酸小檗堿與替加環(huán)素聯(lián)合體外抑制鮑曼不動(dòng)桿菌的作用，為臨床治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染提供新的用藥思路。

1 材料

1.1 儀器

生物安全柜(新加坡藝思高科技有限公司)；麥?zhǔn)媳葷醿x(梅里埃生物制品有限公司)；96孔平底培養(yǎng)板(康寧公司)；恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱(北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司)；冰箱(武漢新世界制冷工業(yè)有限公司)；渦旋混合器(上海五相儀器儀表有限公司)；離心機(jī)(艾本德股份公司)；移液器(艾本德股份公司)；電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Gradient A10 Mill-Q超純水器(法國 Millipore 公司)。

1.2 藥品與試劑

鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)；肉湯粉(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；血平板(梅里埃生物制品有限公司)；黃芩飲片(北京華邈藥業(yè)有限公司)；黃連飲片(北京人衛(wèi)中藥飲片廠)；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)；鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)；替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)；0.9%氯化鈉溶液(石家莊四藥有限公司)；吐溫80(北京邁瑞達(dá)科技有限公司)；二甲基亞砜(德國Sigma公司)。

2 方法

2.1 藥液制備

鑒于臨床用藥規(guī)律，中藥復(fù)方多為水煎服用，故本研究采用水提法。取黃連25.00 g，用8倍純凈水浸泡20 min，煎煮30 min，三層紗布過濾，再加入6倍純凈水，煎煮20 min，合并兩次濾液，濃縮至300 ml后，得到黃連水提物，濃度為83.33 mg生藥/ml，相當(dāng)于生藥濃度。用肉湯稀釋至30.00 mg/ml，離心(2 000 r/min，5 min)后取上清液，再用肉湯2倍倍比稀釋為15.00、7.50、3.75、1.88及0.94 mg/ml，置于渦旋混勻器中充分混勻。同法得到15.00、7.50、3.75、1.88及0.94 mg/ml的黃芩水提物。小量分裝，將其置于4 ℃冰箱冷藏保存。

取適量黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(C21H18O11，分子量為446.37)溶于二甲基亞砜中，配至濃度為10.34 mmol/L。取290 μl于鹽缽中，加入0.40 ml吐溫80研勻，用肉湯定容至1.50 ml，充分混勻，得到黃芩苷工作液，濃度為2 000.00 μmol/L。再用肉湯稀釋為200.00、100.00、50.00、25.00及12.50 μmol/L，充分混勻后小量分裝。同法得到200.00、100.00、50.00、25.00及12.50 μmol/L的鹽酸小檗堿溶液。均置于4 ℃冰箱冷藏保存。

取適量替加環(huán)素標(biāo)品(C29H39N5O8，分子量為585.65)溶于肉湯中，配至濃度為4.27、2.14、1.07、0.53及0.27 μmol/L，充分混勻，得到替加環(huán)素藥液，小量分裝后置于4 ℃冰箱冷藏保存。

2.2 96孔板制備

2.2.1 藥物單用：取黃連藥液40 μl依照濃度由低至高依次加入96孔板的第2—6列，B—G行每行濃度相同；在2—7列(B—G行)加入菌懸液20 μl，在第2—6列(B—G行)加入肉湯40 μl，第7列(B—G行)加入肉湯80 μl，第8列加入肉湯100 μl。此時(shí)第7列為生長對照，第8列為空白對照，B—G行為6組平行實(shí)驗(yàn)。黃連水提物的終濃度由低至高依次為0.38、0.75、1.5、3.00和6.00 mg/ml；鮑曼不動(dòng)桿菌的終濃度為(2.00～3.00)×105CFU/ml(上述體系中二甲基亞砜含量均≤1%，可忽略其對菌體生長的影響)，輕微震蕩以充分混勻，得到黃連單用抑制鮑曼不動(dòng)桿菌培養(yǎng)板。同法得到黃芩、鹽酸小檗堿和黃芩苷單用抑制鮑曼不動(dòng)桿菌培養(yǎng)板，均放置于35 ℃恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

2.2.2 藥物聯(lián)合應(yīng)用：取黃連藥液40 μl按濃度遞增順序由左向右依次注入96孔板的第3—7橫排孔中，共注入6(B—G)行；取替加環(huán)素藥液40 μl按濃度遞減順序由上向下依次注入96孔板的第B—F豎排孔中，共注入6(2—7)列；以上各孔除B7孔外均加入菌懸液20 μl，另外在G2孔加入菌懸液20 μl，不足100 μl的孔均用肉湯補(bǔ)齊。此時(shí)，B7孔為空白對照，G2孔為生長對照，黃連的終濃度由低至高依次為0.38、0.75、1.5、3.00和6.00 mg/ml；替加環(huán)素的終濃度為0.11、0.21、0.43、0.86和1.71 μmol/L；鮑曼不動(dòng)桿菌的終濃度為(2.00～3.00)×105CFU/ml(上述體系中二甲基亞砜含量均<1%，可忽略其對菌體生長的影響)，輕微震蕩以充分混勻，得到黃連聯(lián)合替加環(huán)素抑制鮑曼不動(dòng)桿菌培養(yǎng)板。同法得到黃芩、鹽酸小檗堿和黃芩苷聯(lián)合替加環(huán)素抑制鮑曼不動(dòng)桿菌培養(yǎng)板，均放置于35 ℃恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

2.3 接種和培養(yǎng)

取出96孔板各孔培養(yǎng)液10 μl，用滅菌生理鹽水稀釋106倍，再取稀釋菌液5 μl于血平板中，使用接種環(huán)“Z”字形充分涂開，放置于35 ℃恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h[10]。再根據(jù)平板上的活菌計(jì)數(shù)和稀釋度，按下列公式計(jì)算抑制率：各孔所有標(biāo)本種活菌數(shù)量=20×稀釋倍數(shù)×菌落個(gè)數(shù)；抑制率=(1-各孔中的細(xì)菌數(shù)/生長對照孔中細(xì)菌數(shù))×100% 。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)6遍，計(jì)數(shù)時(shí)取其菌落的平均數(shù)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本課題擬采用體外抑菌實(shí)驗(yàn)，模擬臨床的用藥方法，觀察鮑曼不動(dòng)桿菌在黃連、黃芩、鹽酸小檗堿及黃芩苷等抗菌藥物作用下的生長變化；為進(jìn)一步總結(jié)替加環(huán)素單用對比黃連、黃芩、鹽酸小檗堿和黃芩苷分別與替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用的抑菌效果，本課題采用單因素方差分析進(jìn)行研究，計(jì)算并使用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度黃連、黃芩水提物對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制率比較

當(dāng)藥物濃度相同時(shí)，黃連組對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制能力優(yōu)于黃芩組；其中，黃連3組、黃連4組和黃連5組與對應(yīng)黃芩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他黃連組與黃芩組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

相同濃度條件下，黃連組與黃芩組比較，*P<0.05，**P<0.01with the same concentration, the comparison between coptidis rhizoma group and radix scutellariae group, *P<0.05, **P<0.01圖1 黃連、黃芩水提物對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用比較Fig 1 Comparison of inhibitory effect between the aqueous extract of coptidis rhizoma and radix scutellariae on Acinetobacter baumannii

3.2 不同濃度鹽酸小檗堿、黃芩苷對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制率比較

當(dāng)藥物濃度相同時(shí)，鹽酸小檗堿組對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制能力優(yōu)于黃芩苷組;其中,鹽酸小檗堿4組、鹽酸小檗堿5組與對應(yīng)黃芩苷組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他鹽酸小檗堿組與黃芩苷組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

相同濃度條件下，鹽酸小檗堿組與黃芩苷組比較，*P<0.05，**P<0.01with the same concentration, the comparison between berberine hydrochloride group and baicalin group, *P<0.05, **P<0.01圖2 鹽酸小檗堿、黃芩苷對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用比較Fig 2 Comparison of inhibitory effect between berberine hydrochloride and baicalin on Acinetobacter baumannii

3.3 不同濃度黃連水提物聯(lián)合替加環(huán)素與替加環(huán)素單用對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制率比較

本研究中，生長對照組(CON組)鮑曼不動(dòng)桿菌濃度為(2.00～3.00)×105CFU/ml。當(dāng)替加環(huán)素濃度相同時(shí)，黃連與替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制率略高于替加環(huán)素單用；當(dāng)替加環(huán)素濃度為0.11 μmol/L時(shí)，黃連與替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用的抑制率趨于替加環(huán)素單用(0.21 μmol/L)；但是，隨著替加環(huán)素濃度增大，黃連與替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用的抑制率與替加環(huán)素單用相比，差異越發(fā)不明顯，見圖3。

圖3 黃連水提物聯(lián)合替加環(huán)素與替加環(huán)素單用對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用比較Fig 3 Comparison of inhibitory effect between the aqueous extract of coptidis rhizoma combined with tigecycline and tigecycline alone on Acinetobacter baumannii

3.4 不同濃度黃芩水提物聯(lián)合替加環(huán)素與替加環(huán)素單用對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制率比較

本研究中，CON組鮑曼不動(dòng)桿菌濃度為(2.00～3.00)×105CFU/ml。當(dāng)替加環(huán)素濃度相同時(shí)，黃芩與替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制率略高于替加環(huán)素單用;當(dāng)替加環(huán)素濃度為0.43 μmol/L時(shí)，黃芩與替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用的抑制率略趨于替加環(huán)素單用(0.86 μmol/L)，見圖4。

圖4 黃芩水提物聯(lián)合替加環(huán)素與替加環(huán)素單用對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用比較Fig 4 Comparison of inhibitory effect between the aqueous extract of radix scutellariae combined with tigecycline and tigecycline alone on Acinetobacter baumannii

3.5 不同濃度鹽酸小檗堿聯(lián)合替加環(huán)素與替加環(huán)素單用對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制率比較

本研究中，CON組鮑曼不動(dòng)桿菌濃度為(2.00～3.00)×105CFU/ml。替加環(huán)素與鹽酸小檗堿聯(lián)合應(yīng)用對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制率隨鹽酸小檗堿濃度升高而升高;其中，替加環(huán)素濃度為0.11 μmol/L時(shí)的量效關(guān)系最明顯，且隨鹽酸小檗堿濃度的升高，抑制率接近于高濃度替加環(huán)素組，見圖5。

圖5 鹽酸小檗堿聯(lián)合替加環(huán)素與替加環(huán)素單用對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用比較Fig 5 Comparison of inhibitory effect between berberine hydrochloride combined with tigecycline and tigecycline alone on Acinetobacter baumannii

3.6 不同濃度黃芩苷聯(lián)合替加環(huán)素與替加環(huán)素單用對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制率比較

本研究中，CON組鮑曼不動(dòng)桿菌濃度為(2.00～3.00)×105CFU/ml。當(dāng)替加環(huán)素濃度相同時(shí)，黃芩苷與替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制率略高于替加環(huán)素單用，抑制率隨鹽酸小檗堿濃度升高而升高，見圖6。

圖6 黃芩苷聯(lián)合替加環(huán)素與替加環(huán)素單用對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用比較Fig 6 Comparison of inhibitory effect between Baicalin combined with tigecycline and tigecycline alone on Acinetobacter baumannii

4 討論

4.1 黃連、黃芩對鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抑制作用

5個(gè)不同濃度的黃連、黃芩水提物干預(yù)鮑曼不動(dòng)桿菌后，抑制作用隨著藥物濃度增加而增強(qiáng)，均無半抑制濃度，最高抑制率分別為20.21%、17.96%。高濃度黃連水提物對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用顯著優(yōu)于黃芩水提物。本研究在觀察黃芩水提物對鮑曼不動(dòng)桿菌生長的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)低濃度黃芩水提物的菌濃度與CON組相比略有升高，推測這與黃芩的其他成分、水提時(shí)間有關(guān)。

4.2 鹽酸小檗堿、黃芩苷對鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抑制作用

5個(gè)不同濃度的鹽酸小檗堿、黃芩苷干預(yù)鮑曼不動(dòng)桿菌后，抑制作用隨著藥物濃度增加而增強(qiáng)，均無半抑制濃度，最高抑制率分別為28.12%、25.57%。高濃度鹽酸小檗堿對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用顯著優(yōu)于黃芩苷。

4.3 黃連、黃芩水提物分別聯(lián)合替加環(huán)素與替加環(huán)素單用對鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抑制作用

替加環(huán)素對鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抑制能力顯著強(qiáng)于黃連、黃芩水提物。替加環(huán)素濃度越高，聯(lián)合用藥的抑制率與替加環(huán)素單用相比越無顯著差異。當(dāng)替加環(huán)素濃度為0.11 μmol/L時(shí)，黃連水提物聯(lián)合替加環(huán)素的抑制率趨于替加環(huán)素濃度為0.21 μmol/L時(shí)的抑制率；當(dāng)替加環(huán)素濃度為0.43 μmol/L時(shí)，黃芩水提物聯(lián)合替加環(huán)素的抑制率略趨于替加環(huán)素濃度為0.86 μmol/L時(shí)的抑制率。表明當(dāng)替加環(huán)素處于低濃度時(shí)，黃連、黃芩水提物與替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用可減少替加環(huán)素用量。

4.4 鹽酸小檗堿、黃芩苷分別聯(lián)合替加環(huán)素與替加環(huán)素單用對鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抑制作用

替加環(huán)素對鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抑制能力顯著強(qiáng)于鹽酸小檗堿、黃芩苷。替加環(huán)素濃度越高，聯(lián)合用藥的抑制率與替加環(huán)素單用相比越無明顯差異。當(dāng)替加環(huán)素濃度為0.11 μmol/L時(shí)，鹽酸小檗堿聯(lián)合替加環(huán)素的抑制率趨于替加環(huán)素濃度為0.21 μmol/L時(shí)的抑制率；當(dāng)替加環(huán)素濃度為0.21 μmol/L時(shí)，黃芩苷聯(lián)合替加環(huán)素的抑制率趨于替加環(huán)素濃度為0.43 μmol/L時(shí)的抑制率。推測當(dāng)替加環(huán)素處于一定濃度時(shí)，鹽酸小檗堿、黃芩苷與替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用可考慮適度減少替加環(huán)素的用量。

4.5 黃連、黃芩、鹽酸小檗堿及黃芩苷的作用機(jī)制

黃芩原藥材對多種菌有體外抑制作用[11]；黃芩苷和黃芩素在臨床抗炎治療中應(yīng)用廣泛[12]。黃芩可在體外抗幽門螺桿菌[13]。黃浩等[14]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對沙眼衣原體體外生長具有確切的抑制效應(yīng)。馬曉麗[15]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩苷與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用治療白念珠菌感染具有協(xié)同作用，且能增強(qiáng)白念珠菌對氟康唑的敏感度。周清[16]通過觀察結(jié)核分枝桿菌被黃芩苷作用后，其細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生的變化、菌體細(xì)胞膜與細(xì)胞壁受損的程度，認(rèn)為黃芩苷可以破壞結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，這可能是黃芩苷發(fā)揮抗菌作用的機(jī)制之一。

鹽酸小檗堿是黃連最有效的活性成分之一?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明，黃連單用可抗大鼠胃潰瘍炎癥，且其主要成分鹽酸小檗堿的抗炎活性最為顯著[17]。鹽酸小檗堿對痢疾桿菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、傷寒桿菌及阿米巴原蟲有抑制作用，且與西藥聯(lián)合亦有協(xié)同作用。鹽酸小檗堿與亞胺培南聯(lián)合使用時(shí)能有效提高兩種藥物各自對耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的抗菌敏感性[18]；鹽酸小檗堿與雷貝拉唑鈉腸溶片聯(lián)合使用可有效治療幽門螺旋桿菌感染性胃潰瘍疾病[19]。

鹽酸小檗堿、黃芩苷在抑制鮑曼不動(dòng)桿菌、優(yōu)化抗菌藥物應(yīng)用等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，其對鮑曼不動(dòng)桿菌的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。