孫璽媛， 陳宏， 姜梅， 魏冬梅， 尹鋼， 陳沫嵐， 劉玲玲， 張杰

齊齊哈爾市第一醫(yī)院暨南方醫(yī)科大學(xué)附屬齊齊哈爾醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000

程序性死亡分子1（programmedcelldeath1，PD-1）及其配體程序性死亡分子配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，是肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一，伴隨PD-1/PD-L1抗體在肺癌中的廣泛應(yīng)用，使肺癌患者的無病進(jìn)展生存期、總生存期得到了延長。PDL1 在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)與T 細(xì)胞表面的PD-1 結(jié)合，使T細(xì)胞失能、耗竭，腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷，進(jìn)而增殖，病情惡化。腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡受細(xì)胞周期的調(diào)控[1]。養(yǎng)陰扶正方為臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)方，由《溫病條辨》中的沙參麥冬湯化裁而來，具有益氣養(yǎng)陰、化痰通絡(luò)、散瘀解毒的功效。經(jīng)過十余年的臨床使用，表明養(yǎng)陰扶正方能夠改善非小細(xì)胞肺癌患者的臨床癥狀、生存質(zhì)量和穩(wěn)定瘤灶，基礎(chǔ)研究也證明其具有明確的抗肺癌的作用[2-5]。因此，本研究應(yīng)用免疫磁珠篩選PD-L1+Lewis 肺癌細(xì)胞，經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證后，建立移植瘤模型，研究其與原代Lewis 肺癌細(xì)胞在細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期的差異及養(yǎng)陰扶正方的調(diào)控作用，為養(yǎng)陰扶正方的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞與動(dòng)物

Lewis 肺癌細(xì)胞株：購自美國ATCC 公司；C57BL/6 小鼠，雄性，48 只，鼠齡6 ～8 周，20 ±2 g/只，SPF 級(jí)，購于青島實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（證書編號(hào)：SCXK 2014-0001），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（黑）2016004，本實(shí)驗(yàn)通過《齊齊哈爾市第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法（試行）》倫理審核，倫理編號(hào)為NO.2018-01。

1.1.2 藥品

養(yǎng)陰扶正方由黃芪、黨參、沙參、天冬、麥冬、生白術(shù)、山藥、白花蛇舌草、拳參、絞股藍(lán)、茯苓、莪術(shù)組成，取以上藥加水煎煮二次，每次加10 倍量水，提取2 小時(shí)，濾過后合并濾液，制成5.25 克（生藥）/ml，以上藥品由齊齊哈爾市第一醫(yī)院試劑室提供。 阿特珠單抗（Atezolizumab，PD-L1 抑制劑）購自于美國基因工程技術(shù)公司。

1.1.3 試劑與儀器

細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號(hào)：WLA001a）、細(xì)胞周期檢測試劑盒（批號(hào)：WLA010a）、全蛋白提取試劑盒（批號(hào)：WLA019）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號(hào)：WLA004）、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒（批號(hào)：WLA013）、SDS-PAGE 電泳液（干粉）（批號(hào)：WLA026）、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（批號(hào)：WLA005）、Bax antibody（批號(hào)：WL01637）、Bcl-2 antibody（批號(hào)：WL01556）、脫脂奶粉（批號(hào)：Q/NYLB 0039S）、羊抗兔IgG-HRP（批號(hào)：WLA023）、內(nèi)參抗體β-actin（批號(hào)：WL01845）。

流式細(xì)胞儀（美國艾森生物公司）、Fresco低溫冷凍離心機(jī)、MultiSkan3酶標(biāo)（Thermo公司）；Mini P-4 電泳槽、濕轉(zhuǎn)電泳槽（Cavoy）；分光光度計(jì)（Therno scientific）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；熒光定量PCR儀（Applied Biosystem）。

1.2 方法

1.2.1 PD-L1+Lewis 肺癌及Lewis 肺癌荷瘤鼠模型的建立

體外培養(yǎng)Lewis 肺癌細(xì)胞系，待細(xì)胞至增殖期，應(yīng)用免疫磁珠分選出PD-L1+Lewis 肺癌細(xì)胞系。將PD-L1+Lewis 肺癌細(xì)胞系及Lewis 肺癌細(xì)胞系分別傳代培養(yǎng)，將密度為2×107個(gè)/L 的PD-L1+Lewis 肺癌細(xì)胞懸液及Lewis 肺癌細(xì)胞懸液分別接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下（0.2 ml/只），分別構(gòu)建PDL1+Lewis 肺癌/Lewis 肺癌荷瘤鼠模型。接種10 d后，待皮下移植瘤長至1 cm3左右，剝?nèi)? 只皮下移植瘤行病理檢測均為癌細(xì)胞，說明造模成功。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

將造模成功的荷瘤鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為以下8 組，每組6 只。PD-L1+Lewis 肺癌荷瘤鼠分組：模型組（Control 1 組）、PD-L1 抑制劑組（阿特珠單抗，ATZ組）、養(yǎng)陰扶正方組（YYFZD組）、聯(lián)合組（養(yǎng)陰扶正方+阿特珠單抗，ATZ+YYFZD組）。Lewis 肺癌荷瘤鼠分組：模型組（Control 2組）、PD-L1抑制劑組（阿特珠單抗，ATZ組））、養(yǎng)陰扶正方組（YYFZD 組）、聯(lián)合組（養(yǎng)陰扶正湯+阿特珠單抗，ATZ+YYFZD組）。

1.2.3 給藥方式

1.2.3.1 模型組（Control 1組、Control 2組） 0.2 mL生理鹽水灌胃，共10 d，第1 d、3 d、5 d 0.4 mL生理鹽水腹腔注射。

1.2.3.2 PD-L1 抑制劑組（ATZ 組） 0.2 mL 生理鹽水灌胃，共10 d，第1 d、3 d、5 d 0.4 ml阿特珠單抗（60 mg/kg）腹腔注射。

1.2.3.3 養(yǎng)陰扶正湯組（YYFZD 組） 0.2 ml養(yǎng)陰扶正湯（52 g/kg/d）灌胃，共10 d，第1 d、3 d、5 d 0.4 mL生理鹽水腹腔注射。

1.2.3.4 聯(lián)合組（ATZ+YYFZD 組） 0.2 ml 養(yǎng)陰扶正湯（52 g/kg/d）灌胃，共10 d，第1 d、3 d、5 d 0.4 ml阿特珠單抗（60 mg/kg）腹腔注射。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺癌細(xì)胞調(diào)亡

停藥第2日頸椎脫臼處死各組荷瘤小鼠，無菌剝?nèi)×鼋M織，PBS沖洗，制成單細(xì)胞懸液，分別收集每組細(xì)胞至離心管中，4 ℃下離心2 000 r/min 離心6 min，用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞3 次，低溫下離心5 min，棄上清后加入結(jié)合緩沖液Bingbuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)細(xì)胞，加入5 ul膜聯(lián)蛋白V-FITC（AnnexinV-FITC）結(jié)合液輕輕混勻，在室溫下避光孵育10 min，加入5 ul碘化丙啶染色液，置于冰上遮光反應(yīng)15 min，轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測，分析各組肺癌細(xì)胞凋亡率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺癌細(xì)胞周期。

將1.3 制成的單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度1 ×106/ml，1 000 g，5 min ，沉淀細(xì)胞加入1 ml 70%的冷乙醇固定2 h至過夜，染色前用預(yù)冷的PBS 洗去固定液。加入100 μl RNase A，37 ℃水浴30 min，加入500 μl 碘化丙啶染色液混勻，4 ℃避光30 min。流式儀檢測分析記錄激發(fā)波長488 nm 處紅色熒光。熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出至計(jì)算機(jī)，熒光染料與細(xì)胞DNA 特異性結(jié)合，檢測出細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)像細(xì)胞比例。

1.5 Western-blot檢測瘤組織中Bcl-2、Bax的表達(dá)

瘤組織勻漿，抽提組織蛋白，測定蛋白濃度，加入電泳緩沖液，混勻，100 ℃煮沸5 min，每個(gè)樣分別取25 ug 上樣，4% ～10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉1h 后加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜，PBS-T 洗滌3 次，每次5 min，分別加入羊抗兔或羊抗鼠二抗室溫孵育2 h，PBS-T 洗滌3 次，每次10 min，ECL 顯影，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白βactin 光密度的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 RT-PCR檢測瘤組織中Bcl-2、Bax的基因表達(dá)

①提取樣本總RNA。②紫外吸收測定法檢測濃度和純度，RNA的純度在1.8～2.2之間。③逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。④將所有cDNA 樣品分別配置Realtime PCR 反應(yīng)體系。體系配置如下：2×Master Mix10 μl，10 uM 的PCR 特異引物F0.5 μl，10 uM的PCR 特異引物R0.5 μl，加水至總體積為18 μl，輕彈管底將溶液混合，5 000 rpm 短暫離心。⑤加樣：a將18 ul混合液加到96-PCR 板對(duì)應(yīng)的每個(gè)孔中。b. 再加入對(duì)應(yīng)的2 μl cDNA。c. 小心粘上Sealing Film 封口膜，并短暫離心混合。d.在設(shè)置PCR 程序前將準(zhǔn)備好的PCR 板放在冰上。⑥將上述96-PCR 板置于Realtime PCR 儀上進(jìn)行PCR 反應(yīng)。按以下程序進(jìn)行：95℃，30 秒；40 個(gè)PCR 循環(huán)（95 ℃，5 秒；60 ℃，40 秒）。為了建立PCR 產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按95 ℃，10秒；60 ℃，60秒；95 ℃，15秒進(jìn)行延伸；并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃（儀器自動(dòng)進(jìn)行-Ramp Rate 為0.05 ℃/秒）。⑦各樣品的目的基因和內(nèi)參分別進(jìn)行Realtime PCR 反應(yīng)，每個(gè)樣本檢測3個(gè)復(fù)孔。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

2 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 養(yǎng)陰扶正方對(duì)PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的影響

如表1、圖1 所示，Control 1 組凋亡率（88.35±1.64）%，Control 2 組凋亡率（87.16±1.85）%，兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；在PD-L1+Lewis 肺癌中，與Control 1 組凋亡率比較，ATZ 組凋亡率升高，YYFZD 組凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與ATZ 組凋亡率比較，ATZ+YYFZD 組凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。在Lewis 肺癌，與Control 2 組凋亡率比較，ATZ 組凋亡率升高，YYFZD 組凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與ATZ 組凋亡率比較，ATZ+YYFZD 組凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

表1 養(yǎng)陰扶正方對(duì)PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的影響（±s，%）Table 1 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on the apoptosis of PD-L1+Lewis/Lewis lung cancer cells

表1 養(yǎng)陰扶正方對(duì)PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的影響（±s，%）Table 1 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on the apoptosis of PD-L1+Lewis/Lewis lung cancer cells

注：①與Control 1組比較P ＜0.05；②與Control 2組比較，P ＜0.05；③與ATZ組比較，P ＜0.05

凋亡率PD-L1+Lewis肺癌（n=24）Control 1組88.35±1.64 YYFZD組96.08±1.85①ATZ組94.4±1.25①ATZ+YYFZD組95.32±1.45③Lewis肺癌（n=24）Control 2組87.16±1.85 ATZ+YYFZD組97.81±0.69③ATZ組95.46±1.18②YYFZD組96.67±0.90②

圖1 養(yǎng)陰扶正方對(duì)PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 1 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on the apoptosis of PD-L1+Lewis lung cancer cell/Lewis lung cancer cell

3.2 養(yǎng)陰扶正方對(duì)PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細(xì)胞周期的影響

如表2、圖2 所示，Control 1 組G1 期細(xì)胞數(shù)（54.26±1.02）%、S 期細(xì)胞數(shù)（22.23±1.10）%、G2期細(xì)胞數(shù)（22.85 ± 0.76）%，Control 2 組G1 期細(xì)胞數(shù)（54.69 ± 1.10）%、S 期細(xì)胞數(shù)（21.26 ± 0.54）%、G2 期細(xì)胞數(shù)（23.66±0.60）%，兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。在PD-L1+Lewis 肺癌中，與Control 1 組比較，ATZ 組G1 期細(xì)胞數(shù)增多、S期、G2 期細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與Control 1組比較，YYFZD組G1期細(xì)胞數(shù)增多、S 期細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與ATZ 比較，ATZ+YYFZD 組G1 期細(xì)胞數(shù)增多，S 期、G2 期細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。在Lewis 肺癌，與Control 2 組比較，ATZ 組G1 期細(xì)胞數(shù)增多、S 期、G2 期細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與Control 2 組比較，YYFZD 組G1 期細(xì)胞數(shù)增多、S 期細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與ATZ 比較，ATZ+YYFZD組G1期細(xì)胞數(shù)增多、S期、G2期細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

表2 養(yǎng)陰扶正方對(duì)PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細(xì)胞周期的影響（±s，%）Table 2 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on cell cycle of PD-L1+Lewis/Lewis lung cancer cells

表2 養(yǎng)陰扶正方對(duì)PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細(xì)胞周期的影響（±s，%）Table 2 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on cell cycle of PD-L1+Lewis/Lewis lung cancer cells

注：①與Control 1組比較，P ＜0.05；②與Control 2組比較，P ＜0.05；③與ATZ組比較，P ＜0.05。

Lewis肺癌（n=24）Control組ATZ組YYFZD組ATZ+YYFZD組PD-L1+Lewis肺癌（n=24）G1期54.26±1.02 66.02±0.78①59.65±0.78①76.57±0.63①G2期23.66±0.60 20.43±0.62②17.77±6.01 12.60±0.69③S期22.23±1.10 13.64±1.02①17.16±0.52①8.03±0.71①G2期22.85±0.76 18.69±0.93①22.79±0.40 13.73±0.04③G1期54.69±1.10 65.36±0.59②61.61±1.31②77.69±1.23②S期21.26±0.54 12.85±0.85②15.92±0.57②7.23±0.40②

圖2 養(yǎng)陰扶正方對(duì)PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細(xì)胞周期的影響Figure 2 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on cell cycle of PD-L1+Lewis lung cancer cell/Lewis lung cancer cell

圖3 PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌各組荷瘤鼠Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響。Figure 3 Relative expression of Bcl-2 and Bax protein in lung carcinoma xenograft C57BL/6 mouse models of PD-L1+Lewis and Lewis lung cancer

3.3 養(yǎng)陰扶正方對(duì)PD-L1+ Lewis 肺癌/Lewis 肺癌Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

如圖3、圖4 所示，Control 1 組和Control 2 組的Bcl-2、Bax 蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.93 ± 0.04，0.85 ± 0.07）、（0.24 ± 0.06，0.20 ± 0.06），兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

在PD-L1+Lewis 肺癌中，與Control 1 組比較，ATZ 組Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.37 ± 0.06）減少，Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.94±0.12）增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。YYFZD 組Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.57±0.11）減少，Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.61± 0.03）增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。與ATZ 組比較，ATZ+YYFZD 組Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.22 ± 0.06）減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。在Lewis 肺癌中，與Control 2比較，ATZ 組Bcl-2蛋白表相對(duì)達(dá)量（0.38±0.08）減少，Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.97±0.13）增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。YYFZD 組Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.6±0.11）減少，Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.99±0.12）增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。與ATZ 組比較，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.16 ± 0.04）減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

圖4 West-blot檢測PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌各組荷瘤鼠Bax、Bcl-2蛋白的水平Figure 4 Westblot analysis of Bcl-2 and Bax protein in lung carcinoma xenograft C57BL/6 mouse models of PD-L1+Lewis and Lewis lung cancer

3.4 養(yǎng)陰扶正方對(duì)PD-L1+ Lewis 肺癌/Lewis 肺癌Bax、Bcl-2基因表達(dá)的影響

如 圖5 所 示，Control 1 組 與Control 2 組 的Bax、Bcl-2 的mRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.00 ±0.07，1.01±0.18）、（1.0±0.08，1.00±0.07），兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。在PD-L1+Lewis 肺癌中，與Control 1 組比較，ATZ 組Bcl-2mRNA 相對(duì)表達(dá)量（0.43 ± 0.03）減少，BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量（4.2±0.43）增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；YYFZD 組Bcl-2mRNA 相對(duì)表達(dá)量（0.72 ± 0.05）減少，BaxmRNA 相對(duì)表達(dá)量（2.62 ±0.22）增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。與ATZ組比較，ATZ+YYFZD 組BaxmRNA 相對(duì)表達(dá)量（8.35 ± 0.40）增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。在Lewis 肺癌中，與Control 2比較，ATZ 組Bcl- 2mRNA 表 相 對(duì) 達(dá) 量（0.29 ± 0.02）減 少，BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量（4.23±0.49）增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），YYFZD 組Bcl-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（0.65 ± 0.07）減少，BaxmRNA 相對(duì)表達(dá)量（2.62±0.07）增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。與ATZ 組比較，BaxmRNA 相對(duì)表達(dá)量（6.25±0.4）增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

圖5 PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌各組荷瘤鼠Bax、Bcl-2mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Figure 5 Relative expression of Bcl-2 and Bax mRNA in lung carcinoma xenograft C57BL/6 mouse models of PD-L1+Lewis and Lewis lung cancer

4 討論

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率居均首位的惡性腫瘤，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的最主要原因[6]。在惡性腫瘤中，我國的肺癌男性發(fā)病率居第一位，女性發(fā)病率居第二位，死亡率男、女均第一位[7]。肺癌的整體療效差，其原因之一仍在于肺癌細(xì)胞逃避了宿主的免疫監(jiān)視和殺傷，導(dǎo)致了免疫逃逸的發(fā)生。PD-1及PD-L1 可表達(dá)于多種腫瘤表面的共抑制分子，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，其在介導(dǎo)多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。PD-1單抗以及PD-L1單抗在肺癌的治療中取得了較好的臨床療效，因此，本研究應(yīng)用免疫磁珠法分選出PD-L1+Lewis細(xì)胞，研究其與Lewis細(xì)胞的生物學(xué)行為的差異。本研究結(jié)果顯示PD-L1+Lewis 細(xì)胞和Lewis 細(xì)胞在凋亡率、細(xì)胞周期、凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表達(dá)方面無差異，表明PD-L1+Lewis 細(xì)胞和Lewis 細(xì)胞的生物學(xué)行為相同，也就是說肺癌細(xì)胞表達(dá)PD-L1 并沒有增加肺癌細(xì)胞的惡性行為。

中醫(yī)理論認(rèn)為腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞水平上陰陽平衡失調(diào)，腫瘤細(xì)胞增殖失控（陽盛），凋亡不足（陰衰），細(xì)胞凋亡過少而增殖過多，陽盛陰衰形成腫瘤；當(dāng)?shù)蛲鏊俣却笥谠鲋乘俣?，即陰陽趨向于?dòng)態(tài)平衡態(tài)，則惡性腫瘤消退[8]。本研究表明養(yǎng)陰扶正方促進(jìn)PD-L1+Lewis 細(xì)胞和Lewis 細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞周期阻滯于G1期，降低Bcl-2、增加Bax蛋白及mRNA 的表達(dá)。養(yǎng)陰扶正方通過益氣養(yǎng)陰，解毒散結(jié)，糾正了荷瘤的“陰衰”，促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的凋亡，即細(xì)胞增殖與凋亡趨向于“陰平陽秘”的動(dòng)態(tài)平衡態(tài)，則惡性腫瘤自然消退。同時(shí)養(yǎng)陰扶正方可能作用G1、S 期的限制點(diǎn)，G1 期細(xì)胞數(shù)增多，S期細(xì)胞數(shù)減少，使細(xì)胞周期阻滯于G1 期，進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)減少，發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)增多，抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。

阿特珠單抗是一種針對(duì)PD-L1 的選擇性人源化單克隆IgG1 抗體，作用于PD-L1，阻止其與PD-1的相互作用，阻斷T淋巴細(xì)胞負(fù)性調(diào)控的來源，逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫耐受性并重新建立針對(duì)腫瘤細(xì)胞的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，以此來達(dá)到免疫治療的目的。該藥用于Ⅲ、Ⅳ期NSCLC、無中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的NSCLC、經(jīng)含鉑雙藥治療后進(jìn)展的晚期非小細(xì)胞肺癌、Ⅳ期及新發(fā)轉(zhuǎn)移的非鱗NSCLC 的治療[9]。本研究表明阿特珠單抗可促進(jìn)PD-L1+Lewis、Lewis 細(xì)胞的凋亡，將細(xì)胞周期阻滯于G1期，降低Bcl-2 的蛋白及mRNA 的表達(dá)，促進(jìn)Bax的蛋白及mRNA 的表達(dá)，與養(yǎng)陰扶正方聯(lián)合應(yīng)用，上述作用得到了加強(qiáng)，推測其機(jī)制可能是阿特珠單抗阻止肺癌細(xì)胞上的PD-L1與T細(xì)胞上PD-1 的相互作用，逆轉(zhuǎn)了肺癌細(xì)胞的免疫耐受，T 細(xì)胞的免疫功能得到了有效的發(fā)揮，同時(shí)養(yǎng)陰扶正方增強(qiáng)了阿特珠的功效，其機(jī)制將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。

綜上所述，PD-L1+Lewis 肺癌、Lewis 肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為相同，養(yǎng)陰扶正方通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2 蛋白及mRNA 表達(dá)，促進(jìn)PD-L1+Lewis 肺癌細(xì)胞、Lewis肺癌細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，增加了阿特珠單抗的療效，養(yǎng)陰扶正方與PD-L1抗體的聯(lián)合應(yīng)用，為肺癌的治療提供了新的思路。