鄭志翰，肖 蘭，2，楊盛昌

(1.廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建 廈門 361102； 2.自然資源部海島研究中心，福建 平潭 350400)

竹節(jié)樹(Caralliabrachiata(Lour.) Merr.)是一種陸生紅樹科(Rhizophoraceae)木本植物，主要分布在我國廣東、海南、廣西、臺灣等水熱較為充沛的地區(qū)。竹節(jié)樹在景觀綠化方面應(yīng)用廣泛，有較強的降噪、抗污染、防火和水源保護等能力，經(jīng)濟價值較高，因此竹節(jié)樹野生資源易遭到人為破壞，造成自然種群衰退，甚至在部分地區(qū)面臨消失殆盡的風(fēng)險。

相較于潮間帶紅樹科植物，有關(guān)竹節(jié)樹的研究較少，且主要集中在栽培育種、資源生態(tài)、生理生化、生長發(fā)育等方面[1-4]，涉及分子遺傳及種群生態(tài)學(xué)方面的研究更為缺乏。Kazuo O等[5]發(fā)現(xiàn)竹節(jié)樹染色體數(shù)目為2 n=112，但王瑞江等[6]認為竹節(jié)樹染色體數(shù)目為2 n=48。黃建輝等[7]則認為竹節(jié)樹與非竹節(jié)樹類紅樹科植物之間遺傳差距較大。

種群的空間遺傳結(jié)構(gòu)是指種群中基因型非隨機性的空間分布[8]，地理分布特點、繁殖體傳播方式等是種群空間遺傳結(jié)構(gòu)形成的主要原因。成熟植物個體因無法自由活動，花粉和種子散布過程受到一定的空間限制，因此空間遺傳結(jié)構(gòu)在植物種群內(nèi)普遍存在[9]，通常地理距離近的個體間遺傳相似度高于較遠距離的個體[10]。基因流為生物種內(nèi)或種間基因的傳遞和交換[11]，主要通過花粉和繁殖體等遺傳物質(zhì)攜帶者的傳播來實現(xiàn)。本文以廣東湛江竹節(jié)樹自然小種群為研究對象，采用SSR遺傳標記的方法研究其遺傳變異及空間遺傳結(jié)構(gòu)，為闡述竹節(jié)樹種群的動態(tài)變化及適應(yīng)機制提供分子生態(tài)學(xué)信息，同時為其保護和管理提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 樣地及實驗材料

樣地位于廣東省湛江市高橋鎮(zhèn)(21°35′N、109°45′E)，為典型的亞熱帶季風(fēng)氣候，年均溫23.3 ℃，年均降水量1723 mm。樣地面積約40 hm2，自然生長的竹節(jié)樹密度約0.925株·hm-2，呈零星分布，生長良好，為代表性的植被種類之一。

由前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)此樣地共有竹節(jié)樹29株，其中成年植株21株、小樹8株，此外還有幼苗若干。根據(jù)地理分布特點，將竹節(jié)樹種群分成紅寨、排坡、垌心及江背4個亞種群。2016年6月，對樣地內(nèi)29株竹節(jié)樹進行葉片采集，4個樣地的樣品編號分別為：紅寨1～紅寨9、排坡1～排坡5、垌心1～垌心13、江背1～江背10；同時，為研究竹節(jié)樹種群基因流，隨機采集8株幼苗的葉片(表1)。測量并記錄每株的GPS坐標、株高、胸徑(基徑)、冠幅等地理、形態(tài)學(xué)特征。

表1 竹節(jié)樹樣品基本信息

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取與鑒定 利用天根DP321-03快速提取試劑盒制備竹節(jié)樹基因組，采用紫外分光光度法測定其濃度和純度。

1.2.2 引物與PCR反應(yīng)體系 本研究所用引物篩選自秋茄(Kandeliaobovate)[12-14]、白骨壤(Avicenniamarina)[15-16]、欖李(Lumnitzeraracemosa)[17]。從33對引物中篩選得到核基因組nSSR引物7對、葉綠體基因組cpSSR引物2對，共9對引物用于PCR反應(yīng)(引物信息見表2)。

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增出的產(chǎn)物，委托生物工程(上海)股份有限公司進一步進行毛細管電泳，檢測條帶大小。為便于檢測，引物合成時，在F端添加熒光標記。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

1.3.1 種群遺傳多樣性 利用GenALEx 6.4計算竹節(jié)樹種群的遺傳多樣性參數(shù)，并利用GenePop軟件進行Hardy-Weinberg(HWE)平衡檢驗。

1.3.2 種群遺傳分化 利用GenALEx 6.4的AMOVA方差分析評估亞種群間的遺傳分化大小。利用GenALEx 6.4進行主成分分析(PCoA)，利用Structure軟件進行分組分析。

1.3.3 親本分析及基因流 基于nSSR引物擴增出的條帶情況，使用Cervus 3.07軟件分析8個幼苗的可能父本及母本，并通過坐標計算種子流和花粉流大小，其中種子流為幼苗與潛在母本間的距離，花粉流為幼苗潛在的父母本間的距離。

1.3.4 小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu) 利用SPAGeDi 1.5分析樣地所有區(qū)域亞種群的空間遺傳結(jié)構(gòu)。

表2 引物信息表

2 結(jié)果與分析

2.1 種群遺傳多樣性

竹節(jié)樹種群的遺傳多樣性檢測結(jié)果見表3。竹節(jié)樹種群的Shannon′s多樣性指數(shù)(I)平均值為1.437，觀測雜合度(Ho)為0.436，期望雜合度(He)為0.607。7對nSSR引物平均擴增出等位基因(Na)9.29個。

表3 竹節(jié)樹種群整體遺傳多樣性

對4個亞種群進行HWE平衡檢驗，除了Kaca01之外，其他位點都存在顯著偏離HWE平衡的現(xiàn)象。其中，雜合子缺失占多數(shù)，僅有江背的Kaca04位點存在雜合子過剩。Kcan034、AM98、Lumr28 3個位點均為雜合子缺失。

2.2 種群遺傳分化

圖1 竹節(jié)樹種群主成分分析結(jié)果

對紅寨、排坡、垌心、江背竹節(jié)樹4個亞種群進行遺傳分化分析，亞種群間Fst在0.088～0.181范圍內(nèi)，整體Fst=0.130(P=0.05)，亞種群間的遺傳分化顯著。竹節(jié)樹種群的遺傳變異主要來源于亞種群內(nèi)(80%)，亞種群間的遺傳變異僅占20%。

主成分分析表明，在竹節(jié)樹種群中，垌心亞種群與紅寨亞種群、江背亞種群能較為明顯地區(qū)分開，而紅寨亞種群與江背亞種群二者之間略有重疊；排坡亞種群則與另外3個亞種群混合在一起(圖1)。

竹節(jié)樹分組分析結(jié)果(圖2)表明，種群中存在2個種源——type1和type2。type1主要分布在紅寨和排坡的亞種群中，這2個亞種群的遺傳背景較為簡單；而垌心和江背種群遺傳背景比較復(fù)雜，以type1、type2混雜的種源及type2優(yōu)勢種源為主，并與紅寨、排坡種群之間遺傳分化明顯，在一定程度上反映了兩者在祖先種源上的遺傳背景差異。

圖2 竹節(jié)樹種群的Structure分析

圖3 竹節(jié)樹亞種群單倍型組成及占比

采用cpSSR引物分析發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)樹種群存在3個單倍型(Haplotype)(圖3)，在不同的亞種群中有不同分布。紅寨亞種群和江背亞種群有3個單倍型，排坡僅有單倍型1，垌心則有單倍型1和單倍型2。其中紅寨亞種群中以單倍型2為主，占比達到66.67%，另外2種單倍型較少；江背亞種群以單倍型2和單倍型3為主；垌心亞種群有單倍型1和單倍型2，且占比相當?？赡苤窆?jié)樹種群的祖先以單倍型1為主，之后有其它基因源流入種群，也有可能4個亞種群最初種源不同。

2.3 親本分析及基因流

由于Kcan034位點無效等位基因頻率較高，在親本分析時剔除該位點。基于其余6個位點的幼苗親本分析(表4)表明，5株幼苗可以找到潛在親本。幼苗3和幼苗8可以找到潛在雙親，其具有共同的潛在親本江背1和江背4，且兩潛在親本具有相同的cpDNA，推測與幼苗1、8地理距離較近的江背4為母本，江背1為父本[18]。在親本分析的基礎(chǔ)上，測算竹節(jié)樹種群種子流為50.13～186.36 m，平均值為131.78 m；花粉流為289.64 m。

表4 待測幼苗的潛在親本分析

2.4 小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)

圖中虛線以外為95%置信區(qū)間圖4 竹節(jié)樹種群親緣關(guān)系系數(shù)圖

親緣關(guān)系系數(shù)可以反映小種群空間遺傳結(jié)構(gòu)(圖4)。在竹節(jié)樹種群中，4.41～7.00 m范圍內(nèi)有顯著空間遺傳結(jié)構(gòu)，親緣關(guān)系系數(shù)在間隔為6 m時最大，7 m以后則呈隨機分布的狀態(tài)。竹節(jié)樹種群空間遺傳結(jié)構(gòu)強度sp=0.041。其短距離的空間遺傳結(jié)構(gòu)或與種子的集群分布有關(guān)。

3 討論

3.1 種群遺傳多樣性與Hardy-Weinberg 平衡

王偉等[19]研究了廣東廣州的木棉種群，發(fā)現(xiàn)Ne≤3.159，He=0.418，I=0.687；曾淇等[20]對廣東、海南荔枝種群的研究表明，Na=2.400，He=0.355。顯然，與人工植物種群相比，天然的竹節(jié)樹種群具有較高的遺傳多樣性。

在紅樹科潮間帶植物種群中，Sandoval-Castro等[21]發(fā)現(xiàn)美洲正紅樹(Rhizophoramangle)Ho=0.160、He=0.170；Islam等[22-23]發(fā)現(xiàn)日本主要紅樹植物紅海欖(Rhizophorastylosa)Ho=0.130、He=0.338，秋茄Ho=0.123、He=0.252，木欖(Bruguieragymnorrhiza)Ho=0.314、He=0.408；葛青萍等[24]采用同工酶技術(shù)發(fā)現(xiàn)我國3個木欖種群Ho平均值為0.271，He平均值為0.268。比較而言，陸生竹節(jié)樹種群遺傳多樣性(Ho=0.436，He=0.607)處于較高水平?？赡艹遍g帶的紅樹科植物由于生境較為一致，普遍面臨潮汐淹水和高鹽等脅迫的影響，潮間帶生境對特定基因有較強的選擇作用，導(dǎo)致遺傳多樣性水平較低。而竹節(jié)樹種群生存的陸生生境具有局部復(fù)雜性，在進化過程中保留下來的基因更加多樣，因而竹節(jié)樹種群會有較高的遺傳多樣性。

竹節(jié)樹種群在大多數(shù)位點上顯著偏離HWE平衡，并且為雜合子缺失。基于各位點的等位基因頻率進行的瓶頸效應(yīng)檢測，發(fā)現(xiàn)竹節(jié)樹種群并不存在瓶頸效應(yīng)，可以排除瓶頸效應(yīng)對HWE平衡的影響。推測竹節(jié)樹種群偏離平衡的原因可能有以下2點：①竹節(jié)樹種群是個小種群，僅有37個個體，使得種群的基因頻率發(fā)生隨機偏差，偶然性較大[25]；②砍伐及移除等人類活動可能導(dǎo)致竹節(jié)樹自然種群受到影響。

3.2 種群遺傳分化

Wright[26]認為，當生物種群遺傳系數(shù)大于0.125時，有較大的遺傳分化程度，據(jù)此，可認為竹節(jié)樹種群遺傳分化程度較大。研究發(fā)現(xiàn)，日本西表島紅海欖種群Fst在0.020～0.695之間，秋茄種群Fst在0.028～0.667之間，木欖種群Fst在0.000～0.302之間[22-23]。因此，陸生竹節(jié)樹種群遺傳分化程度低于潮間帶紅樹科植物種群，其原因可能是竹節(jié)樹種群分布面積較小，不同亞種群間地理距離較近，地理分化不明顯。

從基因組角度考慮，竹節(jié)樹種群初始種源較為單一，但不同亞種群間種源的組成差別較大。究其原因，可能與不同亞種群的種源不同有關(guān)，同時也可能與不同亞種群間經(jīng)受的選擇壓力不同有關(guān)，如生境的異質(zhì)性和人為活動(砍伐、移栽等)的影響導(dǎo)致不同亞種群出現(xiàn)分化?？傮w來看，竹節(jié)樹種群中以type1種源為主，該種源可能是竹節(jié)樹種群初始核基因組單倍型。從葉綠體基因組來看，排坡種群只由單倍型1組成，并且單倍型1在4個亞種群中均有分布，表明單倍型1是竹節(jié)樹種群的最早單倍型。不同的單倍型也可能來自于不同的外部種群。竹節(jié)樹種群個體得到補充，一定量持續(xù)穩(wěn)定的基因流可以彌補遺傳風(fēng)險引起的個體喪失，維持甚至于增加小種群的數(shù)量規(guī)模并保存其遺傳多樣性和適合度[27]。

3.3 花粉流及種子流

有研究表明，海南三亞鐵爐港正紅樹植物種群的種子流為20.0 m(1.2～62.2 m)、花粉流為32.8 m(18.1～60.1 m)[28]，很明顯，陸生竹節(jié)樹種群有較大的種子流和花粉流。可能植物種群密度與植物種子流、花粉流大小關(guān)系密切，本研究中，竹節(jié)樹種群密度較小，分布零散，地形的起伏有利于花粉及種子的長距離傳播。此外，現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)，一種鵯鳥會以竹節(jié)樹漿果為食，并攜帶至較遠的位置，這可能是竹節(jié)樹種群有較大種子流的原因之一。阮詠梅等[29]研究發(fā)現(xiàn)，湖北省黃梅縣龍感湖自然保護區(qū)內(nèi)黃梅秤錘樹(Sinojackiahuangmeiensis)的花粉流為23.81 m(0～126.07 m)，種子流為9.07 m(0.22～91.18 m)；熱帶榕屬植物(Ficusdugandii)種群花粉流可達14.20 km(10.90～16.90 km)，F(xiàn)icusobtusifolia種群花粉流可達5.80 km(5.20～6.40 km)[30]。在一定程度上，植物種群大小、分布特征及地形因素等是導(dǎo)致陸生植物種群間基因流差別較大的原因所在。竹節(jié)樹種群的花粉流(289.64 m)大于種子流(131.78 m)，共同構(gòu)成了植物種群的基因流[31-32]。

3.4 種群小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)

黃梅秤錘樹種群在10 m內(nèi)有顯著的空間遺傳結(jié)構(gòu)[29]。潮間帶白骨壤種群有無遺傳結(jié)構(gòu)取決于其地理位置與種群結(jié)構(gòu)，如三亞鐵爐港白骨壤種群在0.0～24.0 m范圍內(nèi)有顯著的空間遺傳結(jié)構(gòu)，而云霄白骨壤種群不具有顯著的空間遺傳結(jié)構(gòu)[28]。本研究中，竹節(jié)樹種群在4.4～7.0 m范圍內(nèi)有顯著空間遺傳結(jié)構(gòu)，可能與種子就近散布有關(guān)。竹節(jié)樹種群的顯著空間遺傳結(jié)構(gòu)表明其能維持正常的繁殖和生態(tài)適應(yīng)。

4 結(jié)論

廣東省湛江市高橋鎮(zhèn)的自然竹節(jié)樹種群有較高的遺傳多樣性及顯著的遺傳分化，F(xiàn)st=0.130。其花粉流和種子流分別為131.78 m和289.64 m。在4.4～7.0 m的范圍內(nèi)，竹節(jié)樹種群有顯著的空間遺傳結(jié)構(gòu)。從目前狀況來看，該種群尚處于健康和穩(wěn)定的狀態(tài)，但應(yīng)加強保護和管理，以避免更多的人為干擾和破壞導(dǎo)致竹節(jié)樹種群資源的衰退甚至消亡。

*：感謝馬益超協(xié)助進行野外調(diào)查及采樣，感謝鄒禎、楊慧和黃含玥在實驗開展以及數(shù)據(jù)處理上給予的幫助。