尹紅梅 劉標(biāo) 郭照輝 許麗娟 杜東霞 陳薇

摘要：為了探索微生物除臭菌對(duì)畜禽糞便中氨氣的處理效果，采用富集、平板劃線分離法，從堆肥樣品中共分離出25株菌株，通過(guò)氨氣選擇性培養(yǎng)基篩選出1株高效抑制氨氣的菌株，命名為菌株YS1。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）rDNA序列同源性比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化分析對(duì)菌株YS1進(jìn)行多相鑒定，初步鑒定該菌株為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。結(jié)果表明，菌株YS1接種到硝化培養(yǎng)基后反應(yīng)96 h，NH+4-N含量從100.0 mg/L下降至9.4 mg/L，NH+4-N 的去除率達(dá)90.6%，體系總氮削減率達(dá)58.6%。在反硝化培養(yǎng)基中反應(yīng)96 h，NO-3-N的濃度由初始的99.3 mg/L下降為17.6 mg/L，降解率達(dá)82.3%，體系總氮削減率達(dá)35.4%。溶血性試驗(yàn)表明，YS1菌株無(wú)溶血性。

關(guān)鍵詞：尖孢鐮刀菌;除臭菌;脫氮;堆肥;NH+4-N;NO-3-N;菌株YS1

中圖分類號(hào)：S182 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）17-0261-05

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖廢棄物大量堆積，導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題，也影響?zhàn)B殖場(chǎng)的衛(wèi)生防疫和人體健康。禽畜糞便是畜禽養(yǎng)殖廢棄物的主要來(lái)源。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖糞污產(chǎn)生量為3.834×109 t，遠(yuǎn)超同期工業(yè)固體廢棄物的排放量，據(jù)初步估計(jì)，到2020年我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的畜禽糞便將超過(guò)60億t[1]。好氧堆肥技術(shù)由于工藝簡(jiǎn)單、能耗低、投資少，被廣泛運(yùn)用于禽畜糞便的處理，但是傳統(tǒng)的好氧堆肥處理容易產(chǎn)生惡臭，氮素?fù)p失嚴(yán)重，不僅污染大氣，還降低了肥料的養(yǎng)分含量。當(dāng)前，除臭保氮技術(shù)是國(guó)內(nèi)外畜禽糞便堆肥研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，但是迄今為止成效甚微。畜禽糞便堆肥產(chǎn)生的惡臭氣體的主要成分是氨氣、硫化氫等，且氨氣占比最大。當(dāng)下畜禽糞便堆肥脫氨除臭的方式多種多樣，可分為物理、化學(xué)、生物、微生物方式等[2]。微生物處理方式是借助微生物的生理功能以及代謝作用，對(duì)其中的惡臭物充分降解，在實(shí)際使用中具有脫臭效果穩(wěn)定突出、避免二次污染等諸多優(yōu)勢(shì)，已成為當(dāng)下解決臭氣問(wèn)題的關(guān)鍵方法之一[3]。微生物脫氨除臭的主要作用機(jī)制是微生物的硝化和反硝化作用[4]，因此這種除臭技術(shù)的關(guān)鍵是篩選得到高效優(yōu)勢(shì)的微生物。

在除臭領(lǐng)域的微生物篩選、產(chǎn)品設(shè)計(jì)中，日本、歐美的技術(shù)更全面先進(jìn)，目前取得了一系列的成果。而我國(guó)該領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究有一定滯后，集中在相關(guān)除臭劑的基礎(chǔ)試驗(yàn)上[5]，具備知識(shí)產(chǎn)權(quán)和科技創(chuàng)新的除臭制劑產(chǎn)品的研究不多。本研究以堆肥腐熟樣為分離材料，分離篩選得到1株脫氨除臭效果好的菌株，命名為YS1。進(jìn)行了形態(tài)觀察、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）測(cè)序等方式鑒定，同時(shí)分析了菌株YS1的降氨能力，以期控制畜禽糞便形成的惡臭氣體，改善生態(tài)環(huán)境，為微生物除臭劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供更多的理論參考及技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

腐熟堆肥樣采自湖南省株洲市某有機(jī)肥廠，用于具有脫臭效果的微生物菌株篩選。

分離培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基等。

NH3選擇性培養(yǎng)基：蔗糖50.0 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.1 g，ZnSO4 0.5 g，NaCl 2.0 g，H2O 1 000 mL 等。

硝化培養(yǎng)基：葡萄糖5.00 g，（NH4）2SO4 0.47 g，NaCl 1.00 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，K2HPO4 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，于121 ℃滅菌20 min。

反硝化培養(yǎng)基：葡萄糖5.000 g，KNO3 0.722 g，NaCl 1.000 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.050 g，K2HPO4 0.500 g，MgSO4·7H2O 0.250 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，于121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 脫氨除臭菌的富集、分離與純化 取腐熟堆肥樣10 g接種于裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，室溫環(huán)境下于180 r/min搖床處理30 min，隨后在搖床中靜置 20 min，取5 mL接種在95 mL NH3培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)5 d，取5 mL發(fā)酵液繼續(xù)接種在NH3培養(yǎng)基中，以淘汰不能利用 NH+4-N 的微生物，如此反復(fù)連續(xù)富集7代。將發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后，涂散在不同的培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，篩選其中長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落，多次分離純化，直至獲得完全純的單菌落，作斜面保存。

1.2.2 脫氨除臭菌的復(fù)篩 參照Liu等的篩選方法[6]，將分離得到的單菌株接種培養(yǎng)過(guò)夜后，以體積比5%的接種量接種至NH3選擇性培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。于培養(yǎng)后24、48、96 h取樣，采用凱氏定氮法測(cè)定NH3的釋放量。

1.2.3 高效脫氨菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)觀察 將目標(biāo)菌株YS1接種至固體培養(yǎng)基平板上，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，觀察菌落的大小、形狀、顏色等屬性，結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》[7]進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3.2 ITS序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增和測(cè)序研究 YS1基因組DNA的提取過(guò)程參照Ferre等的方法[8]完成。結(jié)合真菌ITS引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[9-10]擴(kuò)增ITS rDNA序列。PCR參照劉建利的方法[10]進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化等處理后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。ITS rDNA結(jié)果在GenBank中完成同源性比較，挑選相似性>96%的序列，結(jié)合MEGA 5.0軟件構(gòu)建ITS rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[11]。

1.2.4 溶血性試驗(yàn) 將活化后的YS1及對(duì)照菌株LY-3接種于血平板上，在30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察是否有溶血圈出現(xiàn)，以對(duì)照菌株LY-3作為指示菌株，判斷尖孢鐮刀菌YS1是否具有溶血性[12]。

1.2.5 種子液制備 將斜面上保存的YS1接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h，制得種子液用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.6 脫氮性能的測(cè)定 用“1.2.5”節(jié)中制備形成的菌懸液，以2%的接種量接種至硝化、反硝化培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。每隔24 h取樣，樣品經(jīng)8 000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定NH+4-N、NO-3-N、總氮含量，每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.7 分析測(cè)定 硝基氮含量采用紫外分光光度法進(jìn)行檢測(cè)，氨氮含量采用納氏試劑分光度法進(jìn)行檢測(cè)，總氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定。菌絲干質(zhì)量采用稱質(zhì)量法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件One-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選結(jié)果

豬糞腐熟堆肥樣經(jīng)富集、分離純化后，共獲得25株脫氨除臭菌株。將分離得到的25株菌株接種到NH3選擇性培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，復(fù)篩得到7株脫氨效率較好、生長(zhǎng)旺盛的單菌，分別編號(hào)為YS1、YS3、YS4、YS5、YX1、YX3、YX4。這7株菌株對(duì)氨氣的去除率如表1所示，可以看出，培養(yǎng)48 h后，菌株YS1對(duì)氨氣的降解率達(dá)81.20%，顯著高于其他菌株（P﹤0.05）。最后選擇除氨效率高、生長(zhǎng)速度快的YS1為目標(biāo)菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 菌株YS1的鑒定

2.2.1 菌落及菌體形態(tài)學(xué)觀察 如圖1所示，菌株YS1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落呈白色，突起絮狀，高2～4 mm。菌絲白色質(zhì)密，呈絨毛狀，孢子呈粉質(zhì)，其孢子呈紡錘形。菌落與孢子的形態(tài)特征與鐮刀菌分類鑒定標(biāo)準(zhǔn)基本一致。

2.2.2 ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 PCR擴(kuò)增獲得YS1菌株的ITS序列長(zhǎng)度為532 bp，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)分析，結(jié)果顯示其與Fusarium oxysporum同源性達(dá)98%以上。利用MEGA 5.0軟件對(duì)菌株YS1的ITS rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)合菌株的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)特征及ITS rDNA序列分析的結(jié)果，YS1菌株可鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.3 菌株YS1溶血性

以LY-3為參照菌株，檢測(cè)菌株YS1溶血性。從圖3可以看出，LY-3菌株菌落附近形成了尺寸偏大的溶血圈（圖3-B），而尖孢鐮刀菌YS1菌落周圍沒(méi)有出現(xiàn)溶血圈（圖3-A），說(shuō)明尖孢鐮刀菌YS1不具有溶血性。

2.4 菌株YS1脫氮性能測(cè)定

2.4.1 菌株YS1硝化性能測(cè)定 將菌株YS1種子液以5%的接種量接種于硝化培養(yǎng)基中，考察 NH+4-N 轉(zhuǎn)化情況，結(jié)果見(jiàn)圖4。菌株YS1在24 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，隨后開(kāi)始快速轉(zhuǎn)化NH+4-N，96 h內(nèi)將NH+4-N量從 100.0 mg/L 降至9.4 mg/L，NH+4-N 的去除率達(dá)90.6%。在NH+4-N氧化的同時(shí)，培養(yǎng)基中積累NO-3-N，反應(yīng)48 h后，NO-3-N濃度達(dá)23.4 mg/L，隨后緩慢下降。體系總氮含量初始值為99.6 mg/L，反應(yīng)前24 h，發(fā)酵液的總氮含量維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，24 h 后，體系總氮含量開(kāi)始下降，96 h時(shí)為41.2 mg/L，總氮含量的削減率達(dá)58.6%。證明YS1菌株有良好的硝化性能。

2.4.2 菌株YS1反硝化性能測(cè)定 將菌株YS1接種于反硝化培養(yǎng)基中，測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中菌絲干質(zhì)量及硝態(tài)氮、氨態(tài)氮、總氮含量的變化。由圖5可知，在反應(yīng)96 h時(shí)，YS1菌絲干質(zhì)量達(dá)6.12 mg/mL，表明菌株YS1在反硝化培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)理想。菌株YS1對(duì)數(shù)期后NO-3-N的轉(zhuǎn)化速率很快提升，經(jīng)反應(yīng) 96 h，NO-3-N含量從最初的99.3 mg/L降至 17.6 mg/L，降解率達(dá)82.3%。從圖5中還可以看出，反硝化培養(yǎng)基中有NH+4-N積累，反應(yīng)48 h后，NH+4-N含量達(dá) 18.6 mg/L，隨后逐漸下降。體系總氮含量在菌株YS1進(jìn)入對(duì)數(shù)期后迅速減少，后逐漸穩(wěn)定，反應(yīng)96 h后總氮含量從最初的 99.6 mg/L 減少到64.3 mg/L，削減率為35.4%。初步確定YS1菌株有良好的反硝化性能。

3 討論與結(jié)論

堆肥處理是實(shí)現(xiàn)畜禽糞便無(wú)害化與資源化的一個(gè)十分有效的途徑。堆肥過(guò)程中散發(fā)的惡臭氣體中的主要成分是氨氣、硫化氫、三甲胺等，其中氨氣占比最大。有研究結(jié)果表明，在堆肥過(guò)程中，有98%的氮以NH3形式揮發(fā)損失[13]。氮的損失和形成的惡臭不僅污染環(huán)境，影響人體健康，而且降低了肥料中的養(yǎng)分含量。

本試驗(yàn)以堆肥腐熟樣為分離源，以NH3的釋放量為分析菌株除臭性能的指標(biāo)因素，并從堆肥樣本中分離獲得1株脫氨除臭性能最為突出的菌株YS1，根據(jù)菌株菌落、菌體形態(tài)與ITS rDNA序列分析結(jié)果，鑒定菌株YS1為尖孢鐮刀菌。

溶血性是體外對(duì)相關(guān)菌株安全性測(cè)定過(guò)程中需要分析的關(guān)鍵指標(biāo)之一。根據(jù)溶血特點(diǎn)，可對(duì)該指標(biāo)分成2類：α溶血，表現(xiàn)為菌落周圍存在草綠色的溶血圈，對(duì)人致病力差;β溶血，表現(xiàn)為菌落周圍存在透明溶血圈，易讓人體發(fā)病。若不存在溶血便不會(huì)形成溶血圈。本試驗(yàn)觀察到菌株YS1無(wú)溶血圈形成，說(shuō)明菌株YS1不具有溶血性。

將菌株YS1接種于硝化培養(yǎng)基中，96 h內(nèi)對(duì)氨態(tài)氮的去除率達(dá)90.6%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在NH+4-N氧化的同時(shí)，培養(yǎng)基中積累NO-3-N，反應(yīng)48 h后，NO-3-N含量達(dá)23.4 mg/L。將菌株YS1接種于反硝化培養(yǎng)基中，在96 h內(nèi)對(duì)硝態(tài)氮的去除率達(dá)82.3%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有NH+4-N積累，在反應(yīng)48 h后，NH+4-N 含量達(dá)18.6 mg/L。初步判斷YS1菌株具有良好的硝化、反硝化能力。

以往的反硝化理論指出，反硝化需要在缺氧的環(huán)境下展開(kāi)，溶解氧的存在對(duì)菌株反硝化發(fā)揮了一定的抑制效果。好氧反硝化環(huán)節(jié)中，由于內(nèi)部存在相應(yīng)的還原酶，所以可借助NO-3-N與氧氣，完成協(xié)同呼吸[14]。YS1的菌體中也可能具有相應(yīng)的還原酶，從而可借助氧和硝酸鹽共呼吸，這樣可在好氧環(huán)境下實(shí)現(xiàn)反硝化作用。

本試驗(yàn)篩選得到的尖孢鐮刀菌具有同步硝化與反硝化特性，這在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中鮮見(jiàn)報(bào)道。尖孢鐮刀菌分致病性與非致病性2種。尖孢鐮刀菌致病菌是農(nóng)作物重要的土傳性真菌性病原菌，會(huì)引起植物根部腐爛、維管束褐變及植株萎蔫，導(dǎo)致茄科、芭蕉科與葫蘆科等許多重要農(nóng)作物嚴(yán)重減產(chǎn)[15]。非致病性尖孢鐮刀菌能在植株中定殖，不會(huì)造成植物病害且對(duì)致病性尖孢鐮刀菌有良好的抑制作用，因此已被作為生防菌株應(yīng)用于防治番茄、黃瓜、康乃馨等植物的枯萎病[16-17]。為了確定菌株YS1是否能用于生產(chǎn)實(shí)踐，在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步鑒定其為致病菌株還是非致病性菌株。

本研究從豬糞腐熟堆肥樣中共獲得25株脫氨除臭菌株，通過(guò)氨氣選擇性培養(yǎng)基復(fù)篩，得到1株脫氨除臭效率最高的菌株YS1，經(jīng)鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），該菌株無(wú)溶血性。

菌株YS1具有良好的硝化與反硝化性能。將菌株YS1接種于硝化培養(yǎng)基中，96 h后NH+4-N的去除率達(dá)90.6%;將菌株YS1接種于反硝化培養(yǎng)基中，反應(yīng)96 h后，菌株YS1菌絲干質(zhì)量達(dá) 6.12 mg/mL，NO-3-N的降解率達(dá)82.3%。

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