翟佳佳，張俊娣，左志洪，王 川，張 雷

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050000；2.河北省廊坊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 廊坊 065000；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；4.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

基因增強(qiáng)子和抑制子的鑒定和特性(基因相互作用)是發(fā)現(xiàn)基因功能與基因和(或)通路間串?dāng)_的一種非常有效的方法。基因增強(qiáng)子是一個(gè)基因在另一個(gè)突基因的背景下，突變基因的功能降低，加入增強(qiáng)子后該背景下的突變基因功能進(jìn)一步降低，即增強(qiáng)子基因加重了突變基因的功能，增加了突變基因表型的嚴(yán)重性。在相同培養(yǎng)條件、溫度下，當(dāng)對(duì)線蟲的基因的增強(qiáng)程度進(jìn)行評(píng)分時(shí)，聯(lián)合作用產(chǎn)生的致死率必須高于任何一個(gè)基因單獨(dú)作用產(chǎn)生的致死率。另一方面，基因減弱子是對(duì)一個(gè)基因功能降低的減少，可以減輕突變基因的殺傷力或表型。在半數(shù)致死量的溫度下，加入抑制基因的突變，使致死率降低，該基因即為背景基因的減弱子。秀麗隱桿線蟲結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、基因與人類基因具有高度同源性、易培養(yǎng)，是研究遺傳、基因組和分子網(wǎng)絡(luò)的重要模式。小頭激酶2(minibrain kinase 2，mbk-2)是秀麗隱桿線蟲雙特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，Yak-1)相關(guān)激酶家族中的兩種絲氨酸/蘇氨酸激酶之一。mbk-2在早期胚胎發(fā)育，特別是在單細(xì)胞胚胎的多個(gè)微管依賴過(guò)程中起重要作用，包括原核遷移、紡錘體定位、微管穩(wěn)定性和染色體分離[1]。研究mbk-2在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的特殊功能，可通過(guò)增強(qiáng)或抑制mbk-2的突變表型表達(dá)，觀察基因間的遺傳相互作用來(lái)確定。尋找基因相互作用的有效方法是在攜帶溫度敏感(temperature-sensitive,ts)致死突變的線蟲株背景下進(jìn)行RNAi篩選[2]。前期在紐約大學(xué)Patricia G.Cipriani和Fabio Piano實(shí)驗(yàn)室做了大規(guī)模RNAi的高通量檢測(cè)篩查線蟲的基因，通過(guò)使用這種溫度敏感性突變株，即ts線蟲株，同時(shí)減少兩個(gè)基因的功能，篩查了超過(guò)200 000 000對(duì)可能的相關(guān)基因。其中篩選出了可調(diào)控mbk-2表達(dá)的增強(qiáng)子rsa基因(regulator of spindle assembly,紡錘體集合調(diào)控)[3]。本研究采用秀麗隱桿線蟲mbk-2突變體觀察rsa基因?qū)bk-2的調(diào)控作用，溫度敏感性mbk-2突變株可以在控制溫度的情況下調(diào)節(jié)基因的功能從而控制胚胎致死率。在培養(yǎng)溫度敏感性突變線蟲時(shí)，寬容溫度即胚胎致死率很少時(shí)的溫度，限制溫度即100%致死率時(shí)的溫度。實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)溫度調(diào)整在15 ℃、20 ℃、22.5 ℃和25 ℃。發(fā)現(xiàn)對(duì)于mbk-2突變株，在25 ℃時(shí)致死率為100%，此即該株的限制溫度，在15 ℃時(shí)未孵化的胚胎數(shù)很少，即為該株的寬容溫度。在溫度敏感性的mbk-2突變株顯示出mbk-2蛋白作用在第1次有絲分裂，該ts株顯示出mbk-2功能喪失的表現(xiàn)型，當(dāng)在一個(gè)細(xì)胞階段將培養(yǎng)溫度上升到限制溫度時(shí)表現(xiàn)出100%的胚胎致死率。當(dāng)將胚胎發(fā)育為兩細(xì)胞以后再上升溫度至限制溫度，則有50%的胚胎存活。當(dāng)胚胎發(fā)育到靶細(xì)胞以后的階段再升高溫度至限制溫度，顯示出100%存活率。

1 材料與方法

1.1線蟲株系與菌株 野生型線蟲N2、mbk-2基因敲除型線蟲株系、大腸埃希菌OP50購(gòu)自美國(guó)秀麗線蟲遺傳中心(Caenorhabditis Genetics Center)。

1.2主要儀器及試劑 氨芐青霉素(上海BBI，A610028);羧芐青霉素(美國(guó)Sigma，A6140);L4440質(zhì)粒(美國(guó)Addgene)。體式解剖顯微鏡(廈門Motic);低溫高速離心機(jī)(德國(guó)eppendorf);激光共聚焦成像系統(tǒng)(德國(guó)Leica)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng) 采用線蟲培養(yǎng)基(nematode growth medium,NGM)培養(yǎng)線蟲，稱取NaCl 3 g，瓊脂20 g，蛋白胨2.5 g，溶于975 mL雙蒸水，高壓滅菌。冷卻后，加入1 mol/L CaCl21 mL，5 g/L膽固醇1 mL，1 mol/L MgSO41 mL和1 mol/L KPO4緩沖液25 mL，混勻后導(dǎo)入細(xì)菌培養(yǎng)皿中。室溫放置2 d后，鋪上OP 50菌，室溫放置2 d后即可培養(yǎng)線蟲。

1.3.2線蟲同步化 將線蟲分為mbk-2突變組和N2正常組，每組50只，常規(guī)培養(yǎng)在NGM培養(yǎng)基上，15 ℃生化培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)繁殖。用Bleach裂解液沖洗NGM培養(yǎng)基，震蕩，低速離心，吸取上清液，再加入S-basal溶液，震蕩，離心，吸取上清。重復(fù)2次后加入S-buffer溶液于15 ℃生化恒溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。第2天離心，吸取上清，將剩余部分混勻后，涂抹在NGM培養(yǎng)基上。培養(yǎng)7 d待NGM培養(yǎng)基中的線蟲進(jìn)入產(chǎn)卵期，將正處于產(chǎn)卵期的線蟲挑到NGM培養(yǎng)基上進(jìn)行產(chǎn)卵。2～3 h后將線蟲挑走殺死后，將NGM培養(yǎng)基放進(jìn)15 ℃的生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。第2天觀察存活情況，發(fā)育至幼蟲的最后階段L4期后可用來(lái)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3RNAi干擾試驗(yàn) RNAi細(xì)菌在含有50 g/L氨芐青霉素的LB溶液中于37 ℃振蕩過(guò)夜。將細(xì)菌溶液點(diǎn)在NGM瓊脂平板上(含有100 g/L氨芐青霉素、12.5 g/L四環(huán)素和1 mmol/L IPTG)，并在室溫下誘導(dǎo)細(xì)菌過(guò)夜。在20 ℃條件下，將同步化好的N2及mbk-2基因缺陷線蟲分為2組，各150只線蟲，每組3個(gè)亞組，每亞組50只線蟲，每組在NGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至L4期，喂食RNAi細(xì)菌，分別含有沉默rsa-1和rsa-2基因的質(zhì)粒(沉默組)和L4440空載質(zhì)粒(對(duì)照組)。

1.3.4孵化率測(cè)定 將大約50只線蟲放在裝有300 μL細(xì)菌的RNAi平板上進(jìn)行培養(yǎng)，直到L4期。然后將線蟲轉(zhuǎn)移到裝有30 μL RNAi細(xì)菌的新鮮瓊脂培養(yǎng)平板(每塊平板上有三只蠕蟲)，并將其孵育24 h。然后這些線蟲(新的成蟲)被轉(zhuǎn)移到另一個(gè)RNAi平板上，24 h后移除。將平板上的子代培養(yǎng)24 h后，對(duì)幼蟲和未孵化的蟲卵數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5幼蟲發(fā)育分析 線蟲從L1階段喂食RNAi細(xì)菌，直到線蟲成年產(chǎn)卵前2 d。預(yù)先準(zhǔn)備約0.4 mm厚的瓊脂墊，并在使用前與M9溶液和蓋玻片一起放入溫控培養(yǎng)箱中孵育2 h。在蓋玻片上滴加的2 μL M9緩沖液，并在其中解剖8～10只成蟲，用熔化的凡士林封片，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1rsa基因沉默對(duì)N2線蟲以及mbk-2突變線蟲孵化的影響 采用含rsa-1和rsa-2的RNAi細(xì)菌喂養(yǎng)線蟲，觀察抑制rsa對(duì)線蟲孵化率的影響，對(duì)照組采用含L4440質(zhì)粒的細(xì)菌喂養(yǎng)。結(jié)果顯示，抑制rsa-1和rsa-2表達(dá)后，蟲卵未孵化率高于對(duì)照組(P<0.05)。同時(shí)，RNAi篩選結(jié)果顯示，rsa-1和rsa-2可能是mbk-2的增強(qiáng)子，調(diào)控其表達(dá)。為驗(yàn)證其調(diào)控作用，采用rsa-1和rsa-2的RNAi細(xì)菌喂養(yǎng)mbk-2突變型線蟲。結(jié)果顯示，與N2組相比，mbk-2突變會(huì)增加蟲卵的未孵化率。而采用RNAi抑制rsa-1和rsa-2后，mbk-2突變線蟲的蟲卵未孵化率顯著增加，顯著高于mbk-2突變組，見(jiàn)表1。從培養(yǎng)皿的拍攝圖片也可以直觀的看出，使用L4440的對(duì)照組，幼蟲的數(shù)量多，孵化率很高。rsa-1和rsa-2喂養(yǎng)的mbk-2突變線蟲，卵子數(shù)量明顯增多，幼蟲數(shù)量減少(圖1～2)。

表1 線蟲蟲卵孵化率統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistics of hatchability

圖1 N2線蟲蟲卵孵化檢測(cè)

2.2rsa-2基因沉默對(duì)mbk-2突變線蟲胚胎發(fā)育的影響 為研究rsa-2對(duì)mbk-2的調(diào)控作用，采用rsa-2 RNAi細(xì)菌喂養(yǎng)mbk-2突變線蟲。對(duì)胚胎發(fā)育表型的研究顯示，在單細(xì)胞階段，原核遷移出現(xiàn)缺陷，表現(xiàn)為父原核向中心遷移，并從胚胎后部進(jìn)一步與母原核相遇，并在相遇位置形成紡錘體。并且紡錘體與A-P軸方向不同，可見(jiàn)于電鏡拍攝圖(圖3)。這些缺陷在rsa-2 RNAi干預(yù)的mbk-2突變型線蟲表現(xiàn)的最明顯，但在野生型N2線蟲，使用rsa-2 RNAi單因素處理線蟲及L4440喂養(yǎng)的mbk-2突變型線蟲中表現(xiàn)不明顯。這種表型類似微管不穩(wěn)定性，見(jiàn)表2。

表2 線蟲胚胎發(fā)育表型檢測(cè)Table 2 Detection of embryonic development phenotype of nematode (例數(shù))

在兩細(xì)胞階段，觀察到rsa-2 RNAi喂養(yǎng)的mbk-2突變型線蟲胚胎表現(xiàn)為AB和P1細(xì)胞顯著的不對(duì)稱，也表現(xiàn)為細(xì)胞卵裂溝異常,可見(jiàn)于電鏡拍攝圖(圖4)。這種缺陷與rsa-2 RNAi處理的對(duì)照N2線蟲相似，這表明胚胎表型的異?？赡軆H由rsa-2的缺失引起。

圖4 兩細(xì)胞階段發(fā)育異常情況

3 討 論

mbk-2在秀麗隱桿線蟲早期胚胎發(fā)育中的兩個(gè)主要作用是微管依賴過(guò)程的調(diào)節(jié)和后決定因子的不對(duì)稱分布。mbk-2影響紡錘體方向和位置、原核遷移、微管穩(wěn)定性和染色體分離[4]。這些表型是微管分離蛋白Katanin的同源蛋白減數(shù)分裂紡錘體形成蛋白(meiotic spindle formation protein，MEI-1)控制產(chǎn)生。mbk-2和分裂后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promotingcomplex,APC)通過(guò)直接磷酸化下調(diào)減數(shù)分裂后的MEI-1，使MEI-1失活，以便穩(wěn)定地組裝更大的有絲分裂紡錘體[5]。

mbk-2也是P顆粒不對(duì)稱分布所必需的，也是磷酸化和靶向降解鋅金屬鈦酶(OMA1 zinc metallopeptidase, OMA1)、咽腸過(guò)剩蛋白1(pharynx and intestine in excess protein 1,PIE-1)和后置分離蛋白1(posterior segregation-1，POS-1)等蛋白母體蛋白所必需的[6]。鋅指蛋白OMA-1調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞向胚胎轉(zhuǎn)變。在第一次細(xì)胞分裂期間，需要降解OMA-1以啟動(dòng)細(xì)胞命運(yùn)決定因子的蛋白水解。mbk-2通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)OMA-1的降解。mbk-2還通過(guò)MEX-5/6調(diào)節(jié)PIE-1和POS-1的不對(duì)稱分布[7]。

mbk-2的定位是高度變動(dòng)的。mbk-2定位于卵母細(xì)胞和新受精的受精卵的細(xì)胞皮質(zhì)，并在減數(shù)分裂后期迅速轉(zhuǎn)移到皮質(zhì)點(diǎn)。EGG-3是一種卵子激活所需的卵母細(xì)胞蛋白[8]，與mbk-2形成復(fù)合物，并在減數(shù)分裂前保持其在皮質(zhì)處于非活性狀態(tài)。在減數(shù)分裂期間，EGG-3被內(nèi)化和降解，從皮層釋放出mbk-2[9]。在有絲分裂期間，mbk-2主要發(fā)現(xiàn)于中心體和染色體上。使用溫度敏感的mbk-2突變體進(jìn)行胚胎升溫實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，mbk-2活性在第1次有絲分裂期間是必需的[10]。當(dāng)溫度在單細(xì)胞階段上升到非許可溫度時(shí)，胚胎表現(xiàn)出mbk-2功能喪失表型和100%胚胎致死率。然而溫度升高時(shí)，如果在雙細(xì)胞階段，有50%胚胎存活，如果在八細(xì)胞階段之后，則有100%胚胎存活率。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)溫度升高時(shí)，mbk-2突變體線蟲胚胎發(fā)育出現(xiàn)顯著異常。在單細(xì)胞階段，95%受精卵無(wú)原核遷移，在雙細(xì)胞階段，95%細(xì)胞出現(xiàn)卵裂溝缺陷。

蛋白磷酸化酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是一個(gè)廣泛參與細(xì)胞有絲分裂的酶[11]，其功能包括調(diào)控進(jìn)入有絲分裂周期，復(fù)制中心粒，染色體向中板集合，著絲粒和微管的相互作用，紡錘體集中的管卡，控制有絲分裂的出口[12-13]，PP2A酶有一個(gè)異源三聚體的結(jié)構(gòu),rsa-1和rsa-2蛋白形成一種復(fù)合物(RSA復(fù)合物)，這種復(fù)合物是微管從中心體和紡錘體組件中生長(zhǎng)出來(lái)所必需的。中心體蛋白SPD-5與rsa-2結(jié)合，并將RSA復(fù)合物募集到中心體中[14]。RSA復(fù)合物在有絲分裂紡錘體形成中特異性地起作用，并且通過(guò)紡錘體裝配調(diào)節(jié)劑微管解聚驅(qū)動(dòng)蛋白KLP-7的下調(diào)來(lái)調(diào)節(jié)從中心體發(fā)出的微管的數(shù)量。RSA復(fù)合物還通過(guò)將微管不穩(wěn)定蛋白TPXL-1募集到中心體來(lái)調(diào)節(jié)有絲分裂紡錘體裝配[15]。

秀麗隱桿線蟲使用Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路完成不均質(zhì)的細(xì)胞分裂(asymmetric cell division，ACD)，因此子代細(xì)胞分化自Wnt極化的母代細(xì)胞，并且展示出Wnt信號(hào)[10]，這條信號(hào)通路在線蟲發(fā)育過(guò)程中控制了連續(xù)的前后向的ACD細(xì)胞，指導(dǎo)了反復(fù)的二進(jìn)制細(xì)胞凋亡過(guò)程。這條通路的核心組成部分是SYS-1，它是β連環(huán)蛋白的同源物，也是TCF鏈接的位置，且作用于激活Wnt目標(biāo)基因[16]。在ACD細(xì)胞后，SYS-1不均等的集中到帶有Wnt信號(hào)的子代細(xì)胞核，從而激活Wnt目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。Wnt目標(biāo)基因的表達(dá)激活了細(xì)胞分化程序，區(qū)別于非Wnt信號(hào)的子代細(xì)胞[17]。近期有關(guān)于SYS-1(SYmmetrical Sister cell hermaphrodite gonad defect)不均等的姐妹細(xì)胞雌雄同體性腺缺陷和rsa-2的相關(guān)研究表面，線蟲的中心體細(xì)胞相關(guān)的SYS-1/β連環(huán)蛋白的降解限制了其在不均等細(xì)胞分化后在子代細(xì)胞中的表達(dá)。SYS-1和中心體蛋白rsa-2相互作用，并且在胚胎細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中，rsa-2使SYS-1移動(dòng)到細(xì)胞的中心體。在ACD過(guò)程后，rsa-2使SYS-1從中心體分解，并且促進(jìn)依靠Wnt的細(xì)胞凋亡。rsa-2促進(jìn)SYS-1在中心體上聚集，但是限制SYS-1在分化后保留在子代細(xì)胞[18]。

本研究結(jié)果顯示，利用RNAi細(xì)菌抑制mbk-2突變體線蟲中的rsa-1 和rsa-2后，蟲卵致死率顯著高于L4440喂養(yǎng)的mbk-2突變體線蟲。并且rsa-2 RNAi處理組也顯著高于rsa-1 RNAi處理組，提示mbk-2更多受rsa-2的調(diào)節(jié)作用影響。

rsa-1可以使PP2A全化酶置于細(xì)胞中心體，并且在有絲分裂的紡錘體的聚集起到關(guān)鍵作用。當(dāng)去掉rsa-1功能的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)主要的表現(xiàn)，中心微管減少和紡錘體倒塌，因此細(xì)胞中心體在紡錘體匯合的時(shí)候移向染色質(zhì)[19]。

對(duì)于mbk-2和rsa-2的相互作用，微分干涉差顯微鏡結(jié)果顯示，在單細(xì)胞階段顯示明顯缺陷，如原核遷移缺陷，這類似于mbk-2因微管不穩(wěn)定而喪失功能。這些表型表明，在微管形成過(guò)程中，mbk-2可能需要rsa-2的調(diào)節(jié)。mbk-2在減數(shù)分裂后保持著MEI-1的活性。MEI-1的激活擾亂了有絲分裂紡錘體的穩(wěn)定性。rsa-1和rsa-2復(fù)合物通過(guò)減少紡錘體組件調(diào)節(jié)器KLP-7在有絲分裂紡錘體形成和微管數(shù)量控制中起作用。rsa復(fù)合物還可以通過(guò)募集微管去穩(wěn)定蛋白TPXL-1來(lái)調(diào)節(jié)紡錘體組裝[15]。在兩細(xì)胞階段，相互作用的胚胎產(chǎn)生了夸大的AB和P1細(xì)胞不對(duì)稱，這也出現(xiàn)在N2和rsa-2RNAi對(duì)照中。那么這種表型可能僅僅來(lái)自rsa-2 RNAi的抑制作用。兩細(xì)胞期也出現(xiàn)了胞質(zhì)體，這與15 ℃時(shí)的mbk-2突變體相同。這意味著胞質(zhì)體是僅由降低mbk-2功能產(chǎn)生的。