響應(yīng)面法優(yōu)化Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜难芯?/h1>
2020-10-27 00:53雷珊珊支亞美
中國(guó)造紙學(xué)報(bào) 2020年3期
雷珊珊 石 艷 支亞美 尹 浩 姚 蘭
（湖北工業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院，湖北武漢，430068）
纖維素乙醇，即第二代生物質(zhì)乙醇，是指由富含纖維素的植物纖維原料經(jīng)預(yù)處理、纖維素酶解及酵母發(fā)酵等過(guò)程制備得到的液體燃料。其中，預(yù)處理是必不可少的重要步驟，主要作用為破除木質(zhì)纖維原料的酶解障礙，增加纖維素在酶解過(guò)程中的可及度以提高葡萄糖得率［1］。預(yù)處理方法包括物理法、化學(xué)法和生物法。其中，化學(xué)法是最有可能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的一種預(yù)處理方法，主要包括酸預(yù)處理、堿預(yù)處理和有機(jī)溶劑預(yù)處理［1］。Fenton反應(yīng)由于產(chǎn)生具有高氧化強(qiáng)度的羥基自由基（·OH），可以模擬木質(zhì)纖維素的生物降解［2-4］，具有低能耗、抑制物產(chǎn)生少等優(yōu)點(diǎn)，是目前最有前途的預(yù)處理技術(shù)之一［5-7］。H2O2是一種氧化性很強(qiáng)的氧化劑，在低濃度下其反應(yīng)速率很慢，但加入鐵鹽后會(huì)顯著增加其氧化性，在酸性條件下可產(chǎn)生羥基自由基（Fe2++H2O2=Fe3++·OH+OH-）［8］。目前，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理已經(jīng)應(yīng)用于處理稻草，并獲得了93.2%的酶解糖化產(chǎn)率［9］。Fenton氧化與NaOH萃取結(jié)合預(yù)處理甘蔗渣，在同步糖化發(fā)酵條件下酶解率為64.7%，乙醇濃度可達(dá)17.44 g/L［10］。研究表明，鐵鹽的種類和濃度、pH值及H2O2的加入量都會(huì)影響Fenton氧化預(yù)處理的效果［5-6］。最近的一項(xiàng)研究在對(duì)FeSO4·7H2O、FeCl2·4H2O、Fe2（SO4）3和FeCl3·6H2O進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)eCl3·6H2O是Fenton氧化預(yù)處理稻稈最有效的鐵鹽［6］。當(dāng)使用三價(jià)鐵鹽參與Fenton反應(yīng)時(shí)，首先發(fā)生的反應(yīng)是Fe3++H2O2=Fe2++·OOH+H+，然后生成Fe2+再與H2O2反應(yīng)生成·OH。且鑒于二價(jià)鐵鹽在實(shí)際應(yīng)用中往往不穩(wěn)定；因此，本研究采用三價(jià)鐵鹽進(jìn)行Fenton氧化預(yù)處理。
響應(yīng)面法是優(yōu)化多個(gè)交叉因子獲得最大產(chǎn)值的一種數(shù)學(xué)模型類優(yōu)化工具［11］，可以從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中解決多元方程的問(wèn)題，并且可以同時(shí)計(jì)算和評(píng)估這些因子從而得出最佳設(shè)計(jì)方案［12］，在預(yù)處理植物纖維原料制備生物質(zhì)乙醇的高值化利用研究中已有諸多應(yīng)用［13-15］。本研究以楊木為原材料，以Fenton氧化預(yù)處理得率和葡萄糖得率作為考察指標(biāo)，探討H2O2/FeCl3（體積比，下同）、pH值及FeCl3濃度對(duì)Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜挠绊?。在單因素?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用中心組合-響應(yīng)面法優(yōu)化了Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜墓に嚄l件，以期為生物質(zhì)材料制備生物質(zhì)乙醇提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1實(shí)驗(yàn)原料
楊木，取自湖北某農(nóng)場(chǎng)，經(jīng)植物粉碎機(jī)（FZ102，天津市泰斯特儀器有限公司）粉碎后取40～60目組分，經(jīng)苯-醇（2∶1，體積比）抽提脫除脂溶物后待用。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1Fenton氧化預(yù)處理
取上述制備的楊木粉10 g加入到500 mL三角瓶中，按固液比為1∶20（m/V）配置預(yù)處理液并搖勻，在40℃保溫反應(yīng)24 h后，進(jìn)行固液分離并清洗預(yù)處理后的固料至中性，將固料放于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，根?jù)式（1）計(jì)算Fenton氧化預(yù)處理得率。
式中，Y為Fenton氧化預(yù)處理得率，%；m1為預(yù)處理后固料的質(zhì)量，g；s1為預(yù)處理后固料的含水率，%；10為楊木粉的取樣質(zhì)量，g；s2為楊木粉的含水率，%。
1.2.1.1單因素實(shí)驗(yàn)
本研究主要考察H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度對(duì)Fenton氧化預(yù)處理得率及葡萄糖得率的影響。單因素實(shí)驗(yàn)中，H2O2/FeCl3分別為5%、10%、25%和75%，pH值分別為1.5、2.0、2.5和3.0，F(xiàn)eCl3濃度分別為10、25、50和75 mmol/L。
1.2.1.2中心組合-響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)找出以H2O2/FeCl3、pH值和FeCl3濃度為自變量的中心點(diǎn)。然后以-1、0、1分別說(shuō)明3個(gè)自變量的低、中、高水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算分析每一預(yù)處理?xiàng)l件的得率和葡萄糖得率。以H2O2/FeCl3、pH值、FeCl3濃度三選二為自變量，以預(yù)處理得率和葡萄糖得率為因變量作圖，得到最佳處理?xiàng)l件。設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，具體見(jiàn)表1。
表1 中心組合-響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平
1.2.2Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜睦w維素酶解
稱取0.50 g絕干Fenton氧化預(yù)處理后楊木置于50 mL潔凈三角瓶?jī)?nèi)，纖維素酶加入量為25 FPU/g。使用pH值為4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（CH3COOHCH3COONa，0.2 mol/L）配置纖維素酶溶液，并加入1 g/L疊氮鈉抑制微生物的生長(zhǎng)。將三角瓶移入ZHWY-2112B搖床中（上海市智誠(chéng)分析儀器有限公司），反應(yīng)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，反應(yīng)72 h后取一定量的酶解液，在8000 r/min條件下離心5 min，上清液用于葡萄糖得率分析。
1.3分析方法
1.3.1葡萄糖得率的測(cè)定
采用高效液相儀（日本島津）測(cè)定葡萄糖含量，具體測(cè)定條件為：Aminex HPX-87P色譜柱（美國(guó)Bio-Rad），柱溫65℃，流動(dòng)相為超純水，流速為0.6 mL/min，示差檢測(cè)器，根據(jù)濃度和峰面積繪制葡萄糖（色譜純）標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測(cè)出的葡萄糖質(zhì)量計(jì)算葡萄糖得率，見(jiàn)式（2）。
式中，C為葡萄糖得率，%；0.50為Fenton氧化預(yù)處理后的楊木取樣絕干質(zhì)量，g；m3為Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅久附獾玫降钠咸烟琴|(zhì)量，g。
1.3.2成分分析
木質(zhì)纖維原料的成分分析測(cè)定按照文獻(xiàn)［16］描述的方法進(jìn)行。本研究所用楊木的成分分析結(jié)果如表2所示。
表2 楊木成分分析 %
1.3.3X射線衍射（XRD）分析
采用XRD（荷蘭帕納科銳影）檢測(cè)Fenton氧化預(yù)處理前后楊木的結(jié)晶度，掃描范圍為2θ=10°～50°。
1.3.4比表面積分析
采用ASAP2020物理吸附儀（美國(guó)麥克瑞默爾公司），根據(jù)氣體吸附BET法測(cè)定樣品的比表面積，測(cè)定條件為：脫氣溫度50℃，脫氣時(shí)間8 h。具體步驟參見(jiàn)GB/T 19587—2004。
1.3.5掃描電子顯微鏡（SEM）分析
采用SU8010 SEM（日本日立）觀察Fenton氧化預(yù)處理前后楊木的微觀形態(tài)，測(cè)試前對(duì)樣品進(jìn)行鍍金處理。
2 結(jié)果與討論
2.1單因素實(shí)驗(yàn)
研究H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度對(duì)Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅酒咸烟堑寐实挠绊懀Y(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著預(yù)處理液中H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度的增大，葡萄糖得率都呈先上升后下降的趨勢(shì)，這一結(jié)果與前期其他研究者得到的結(jié)果一致。結(jié)果表明，當(dāng)Fe3+濃度達(dá)到一定值后，繼續(xù)增加Fe3+的濃度會(huì)抑制纖維素酶的活性［10］；此外，高于或低于最佳pH值也會(huì)影響Fenton氧化反應(yīng)［17］。綜上，H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度的最佳值分別為10%、2.5和50 mmol/L。
圖1 H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度對(duì)Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅酒咸烟堑寐实挠绊?/p>
2.2中心組合實(shí)驗(yàn)
為了驗(yàn)證單因素實(shí)驗(yàn)得出的Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜淖罴褩l件（H2O2/FeCl3=10%，pH值2.5，F(xiàn)eCl3濃度50 mmol/L），設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)對(duì)這一條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。將最佳條件作為中心點(diǎn)條件代入表1中得到所有的預(yù)處理?xiàng)l件，具體條件及結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅局行慕M合實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果
從表3可以看出，楊木經(jīng)Fenton氧化預(yù)處理后得率相差不大，基本都在80%～95%，表明與其他方法相比，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理可以獲得更高的預(yù)處理得率［1，18］。H2O2作為一種強(qiáng)氧化劑，可以氧化脫除木質(zhì)纖維原料中的組分；由表3可知，當(dāng)H2O2/FeCl3為5%時(shí)，其預(yù)處理得率較H2O2/FeCl3為10%和15%時(shí)高，說(shuō)明在Fenton氧化反應(yīng)中，過(guò)量的H2O2會(huì)導(dǎo)致纖維素纖維的降解［8］，反而使預(yù)處理得率降低。在酸性條件下，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理可產(chǎn)生高度活性的·OH，因此pH值對(duì)Fenton氧化預(yù)處理也有較大影響。對(duì)比11#、12#和15#3組預(yù)處理?xiàng)l件可以發(fā)現(xiàn)，在其他條件相同時(shí)，改變Fenton氧化預(yù)處理的pH值對(duì)預(yù)處理得率的影響不大，但總的趨勢(shì)是隨著pH值的提高，預(yù)處理得率下降。葡萄糖得率受pH值影響較大，當(dāng)pH值為2.0和3.0時(shí)，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理?xiàng)钅酒咸烟堑寐蕛H為約20%，而pH值為2.5時(shí)，葡萄糖得率可增至50%以上，說(shuō)明在這一pH值條件下，體系中參與Fenton氧化的Fe3+濃度達(dá)到了最大值［19］。以上結(jié)果說(shuō)明，以預(yù)處理得率和葡萄糖得率為依據(jù)，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜淖罴褩l件為H2O2/FeCl3=10%，pH值2.5，F(xiàn)eCl3濃度50 mmol/L。
2.3響應(yīng)面分析
2.3.1響應(yīng)面法分析Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)葡萄糖得率的影響
根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)，運(yùn)用軟件STATISTICA10.0繪制Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)l件與葡萄糖得率之間的關(guān)系圖，結(jié)果如圖2所示。
圖2 Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)葡萄糖得率影響的響應(yīng)面圖
從圖2可以看出，隨著H2O2/FeCl3、pH值、FeCl3濃度的逐漸增大，葡萄糖得率呈先增大后下降的趨勢(shì)，在響應(yīng)面的中心點(diǎn)出現(xiàn)一個(gè)最大值，即在中心點(diǎn)處葡萄糖得率最大。在中心點(diǎn)條件下，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理?xiàng)钅酒咸烟堑寐士蛇_(dá)51.4%。這一葡萄糖得率是基于初始原料質(zhì)量計(jì)算得到的，如果以原料中聚葡萄糖含量為基準(zhǔn)（理論值100%）計(jì)算，在中心點(diǎn)條件下，葡萄糖得率可高達(dá)理論值的94.7%，遠(yuǎn)高于其他預(yù)處理方法［1，20-23］，說(shuō)明Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅究色@得較高的葡萄糖得率。
用軟件Minitab17分析Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)葡萄糖得率的影響可知，H2O2/FeCl3對(duì)葡萄糖得率影響的p值為0.445（p＞0.1），pH值對(duì)葡糖得率影響的p值為0.157（p＞0.1），這兩者p值均大于0.1，說(shuō)明H2O2/FeCl3和pH值對(duì)葡萄糖得率無(wú)顯著性影響。而FeCl3濃度對(duì)葡萄糖得率影響的p值為0.035（p＜0.05），由此可知，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理?xiàng)钅緯r(shí)，F(xiàn)eCl3濃度對(duì)葡萄糖得率的影響最顯著。
2.3.2Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)脫木質(zhì)素的影響
研究表明，木質(zhì)素的脫除可以顯著增加木質(zhì)纖維原料的酶解得率，因?yàn)槟举|(zhì)素會(huì)在酶解過(guò)程中對(duì)纖維素酶造成無(wú)效吸附而降低有效酶活［24-25］。有研究表明，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理可改變木質(zhì)纖維原料中木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)而增加其酶解效率［7］，因此本研究測(cè)定了不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)楊木脫木質(zhì)素的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)楊木脫木質(zhì)素的影響
從表4可以看出，經(jīng)Fenton氧化預(yù)處理過(guò)后，楊木中的木質(zhì)素有不同程度的脫除。2#預(yù)處理?xiàng)l件下木質(zhì)素脫除率最高，為35.6%；而1#預(yù)處理?xiàng)l件下，楊木木質(zhì)素脫除率不到1%。在最佳預(yù)處理?xiàng)l件（15#）下，木質(zhì)素脫除率為26.1%。雖然前期的研究［26］表明，木質(zhì)素的脫除有利于纖維素酶解效率的提高，但在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，并未發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素脫除率與葡萄糖得率的直接相關(guān)性，說(shuō)明Fenton氧化預(yù)處理提高木質(zhì)纖維原料的酶解效率不僅在于木質(zhì)素的脫除，可能還包括原料其他性質(zhì)的變化，如纖維素結(jié)晶度和纖維素聚合度等的改變。
用軟件Minitab17分析Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)楊木脫木質(zhì)素的影響可知，H2O2/FeCl3對(duì)楊木脫木質(zhì)素影響的p值為0.012（p＜0.05），pH值對(duì)楊木脫木質(zhì)素影響的p值為0.846（p＞0.1），F(xiàn)eCl3濃度對(duì)楊木脫木質(zhì)素影響的p值為0.324（p＞0.1），由此可知，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理?xiàng)钅緯r(shí)，H2O2/FeCl3對(duì)脫木質(zhì)素影響最顯著。
2.4Fenton氧化預(yù)處理對(duì)楊木性能的影響
2.4.1Fenton氧化預(yù)處理對(duì)楊木纖維素結(jié)晶度的影響
有研究結(jié)果表明，木質(zhì)纖維原料的纖維素結(jié)晶度對(duì)其酶解性可能有較大的影響，因?yàn)闊o(wú)定形區(qū)較結(jié)晶區(qū)更容易被酶解。但其他相關(guān)研究［27-28］也表明，對(duì)于預(yù)處理后的木質(zhì)纖維原料來(lái)說(shuō)，纖維素結(jié)晶度對(duì)其酶解性能可能沒(méi)有影響。Fenton氧化預(yù)處理前后楊木的XRD譜圖如圖3所示。由圖3可知，楊木的XRD譜圖呈典型的纖維結(jié)構(gòu)特征。由計(jì)算得到，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理前楊木的纖維素結(jié)晶度為39.9%，經(jīng)最佳預(yù)處理?xiàng)l件處理后，楊木的纖維素結(jié)晶度上升至45.0%，較預(yù)處理前提高了12.8%。預(yù)處理后木質(zhì)纖維原料的纖維素結(jié)晶度提高在其他研究中也有報(bào)道［28-30］。纖維素結(jié)晶度的提高說(shuō)明Fenton氧化預(yù)處理主要破壞了楊木纖維中的纖維素?zé)o定形區(qū)，脫除了部分半纖維素和木質(zhì)素［6］；此外，也可能是纖維素發(fā)生氫鍵重排，造成重結(jié)晶現(xiàn)象導(dǎo)致的。
圖3 Fenton氧化預(yù)處理前后楊木的XRD譜圖
2.4.2Fenton氧化預(yù)處理對(duì)楊木比表面積的影響
本研究采用氣體吸附BET法測(cè)定了Fenton氧化預(yù)處理前后楊木的比表面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，楊木的比表面積由預(yù)處理前的0.91 m2/g增加到預(yù)處理后的1.63 m2/g（最佳預(yù)處理?xiàng)l件下），較預(yù)處理前提高了80.2%。比表面積的增加有利于纖維素酶與底物的接觸，可使更多的纖維素被纖維素酶降解為葡萄糖而提高葡萄糖得率。這與其他研究［28-29］得到的結(jié)果一致，即木質(zhì)纖維原料經(jīng)預(yù)處理后，其比表面積的增大與其纖維素轉(zhuǎn)化率的增加有正相關(guān)關(guān)系。
2.4.3Fenton氧化預(yù)處理對(duì)楊木表面形態(tài)的影響
Fenton氧化預(yù)處理前后楊木的SEM圖如圖4所示。從圖4可以看出，未經(jīng)過(guò)預(yù)處理的楊木，其表面平滑、致密有序，說(shuō)明細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素相互交織在一起。Fenton氧化預(yù)處理后的楊木表面變得比較粗糙，有裂痕以及孔洞的存在，結(jié)構(gòu)變得松散。另外，楊木的表面出現(xiàn)了大量的凹陷和裂痕，這在一定程度上提高了物料的比表面積，增加了纖維素酶分子與纖維素的接觸位點(diǎn)，從而促進(jìn)纖維素酶對(duì)纖維素的降解。
綜上可知，經(jīng)Fenton氧化預(yù)處理后，楊木的纖維素結(jié)晶度提高，比表面積增加，且結(jié)構(gòu)變得粗糙松散。其中，楊木比表面積的增大和結(jié)構(gòu)的改變可能增加了纖維素酶與纖維素的作用位點(diǎn)和可及度，促進(jìn)了纖維素酶對(duì)楊木纖維的酶解程度，最終提高了葡萄糖得率。
圖4 （a，c）未處理?xiàng)钅竞停╞，d）Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜腟EM圖
3 結(jié)論
以楊木為原料，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)（H2O2/FeCl3（體積比，下同）、pH值和FeCl3濃度）及中心組合-響應(yīng)面法優(yōu)化了Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜淖罴褩l件。采用成分分析、X射線衍射（XRD）、比表面積分析及掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)預(yù)處理前后的楊木進(jìn)行了表征，主要結(jié)論如下。
3.1Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜淖罴褩l件為：H2O2/Fe-Cl3=10%，pH值2.5，F(xiàn)eCl3濃度50 mmol/L。在最佳預(yù)處理?xiàng)l件下，楊木的葡萄糖得率可達(dá)51.4%，為理論值的94.7%。
3.2通過(guò)Minitab17軟件分析得到FeCl3濃度對(duì)Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅酒咸烟堑寐实挠绊懽铒@著，H2O2/FeCl3對(duì)脫木質(zhì)素影響最顯著。
3.3Fenton氧化預(yù)處理過(guò)程中脫除了部分木質(zhì)素，在最佳預(yù)處理?xiàng)l件下，木質(zhì)素脫除率達(dá)到26.1%。Fenton氧化預(yù)處理提高了楊木的纖維素結(jié)晶度（由預(yù)處理前的39.9%提高至45.0%）和比表面積（由預(yù)處理前的0.91 m2/g提高至1.63 m2/g）。楊木比表面積的增大和表面結(jié)構(gòu)的改變促進(jìn)了纖維素的酶降解，提高了Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜钠咸烟堑寐省?/p>
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雷珊珊 石 艷 支亞美 尹 浩 姚 蘭
（湖北工業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院，湖北武漢，430068）
纖維素乙醇，即第二代生物質(zhì)乙醇，是指由富含纖維素的植物纖維原料經(jīng)預(yù)處理、纖維素酶解及酵母發(fā)酵等過(guò)程制備得到的液體燃料。其中，預(yù)處理是必不可少的重要步驟，主要作用為破除木質(zhì)纖維原料的酶解障礙，增加纖維素在酶解過(guò)程中的可及度以提高葡萄糖得率［1］。預(yù)處理方法包括物理法、化學(xué)法和生物法。其中，化學(xué)法是最有可能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的一種預(yù)處理方法，主要包括酸預(yù)處理、堿預(yù)處理和有機(jī)溶劑預(yù)處理［1］。Fenton反應(yīng)由于產(chǎn)生具有高氧化強(qiáng)度的羥基自由基（·OH），可以模擬木質(zhì)纖維素的生物降解［2-4］，具有低能耗、抑制物產(chǎn)生少等優(yōu)點(diǎn)，是目前最有前途的預(yù)處理技術(shù)之一［5-7］。H2O2是一種氧化性很強(qiáng)的氧化劑，在低濃度下其反應(yīng)速率很慢，但加入鐵鹽后會(huì)顯著增加其氧化性，在酸性條件下可產(chǎn)生羥基自由基（Fe2++H2O2=Fe3++·OH+OH-）［8］。目前，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理已經(jīng)應(yīng)用于處理稻草，并獲得了93.2%的酶解糖化產(chǎn)率［9］。Fenton氧化與NaOH萃取結(jié)合預(yù)處理甘蔗渣，在同步糖化發(fā)酵條件下酶解率為64.7%，乙醇濃度可達(dá)17.44 g/L［10］。研究表明，鐵鹽的種類和濃度、pH值及H2O2的加入量都會(huì)影響Fenton氧化預(yù)處理的效果［5-6］。最近的一項(xiàng)研究在對(duì)FeSO4·7H2O、FeCl2·4H2O、Fe2（SO4）3和FeCl3·6H2O進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)eCl3·6H2O是Fenton氧化預(yù)處理稻稈最有效的鐵鹽［6］。當(dāng)使用三價(jià)鐵鹽參與Fenton反應(yīng)時(shí)，首先發(fā)生的反應(yīng)是Fe3++H2O2=Fe2++·OOH+H+，然后生成Fe2+再與H2O2反應(yīng)生成·OH。且鑒于二價(jià)鐵鹽在實(shí)際應(yīng)用中往往不穩(wěn)定；因此，本研究采用三價(jià)鐵鹽進(jìn)行Fenton氧化預(yù)處理。
響應(yīng)面法是優(yōu)化多個(gè)交叉因子獲得最大產(chǎn)值的一種數(shù)學(xué)模型類優(yōu)化工具［11］，可以從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中解決多元方程的問(wèn)題，并且可以同時(shí)計(jì)算和評(píng)估這些因子從而得出最佳設(shè)計(jì)方案［12］，在預(yù)處理植物纖維原料制備生物質(zhì)乙醇的高值化利用研究中已有諸多應(yīng)用［13-15］。本研究以楊木為原材料，以Fenton氧化預(yù)處理得率和葡萄糖得率作為考察指標(biāo)，探討H2O2/FeCl3（體積比，下同）、pH值及FeCl3濃度對(duì)Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜挠绊?。在單因素?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用中心組合-響應(yīng)面法優(yōu)化了Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜墓に嚄l件，以期為生物質(zhì)材料制備生物質(zhì)乙醇提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1實(shí)驗(yàn)原料
楊木，取自湖北某農(nóng)場(chǎng)，經(jīng)植物粉碎機(jī)（FZ102，天津市泰斯特儀器有限公司）粉碎后取40～60目組分，經(jīng)苯-醇（2∶1，體積比）抽提脫除脂溶物后待用。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1Fenton氧化預(yù)處理
取上述制備的楊木粉10 g加入到500 mL三角瓶中，按固液比為1∶20（m/V）配置預(yù)處理液并搖勻，在40℃保溫反應(yīng)24 h后，進(jìn)行固液分離并清洗預(yù)處理后的固料至中性，將固料放于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，根?jù)式（1）計(jì)算Fenton氧化預(yù)處理得率。
式中，Y為Fenton氧化預(yù)處理得率，%；m1為預(yù)處理后固料的質(zhì)量，g；s1為預(yù)處理后固料的含水率，%；10為楊木粉的取樣質(zhì)量，g；s2為楊木粉的含水率，%。
1.2.1.1單因素實(shí)驗(yàn)
本研究主要考察H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度對(duì)Fenton氧化預(yù)處理得率及葡萄糖得率的影響。單因素實(shí)驗(yàn)中，H2O2/FeCl3分別為5%、10%、25%和75%，pH值分別為1.5、2.0、2.5和3.0，F(xiàn)eCl3濃度分別為10、25、50和75 mmol/L。
1.2.1.2中心組合-響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)找出以H2O2/FeCl3、pH值和FeCl3濃度為自變量的中心點(diǎn)。然后以-1、0、1分別說(shuō)明3個(gè)自變量的低、中、高水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算分析每一預(yù)處理?xiàng)l件的得率和葡萄糖得率。以H2O2/FeCl3、pH值、FeCl3濃度三選二為自變量，以預(yù)處理得率和葡萄糖得率為因變量作圖，得到最佳處理?xiàng)l件。設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，具體見(jiàn)表1。
表1 中心組合-響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平
1.2.2Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜睦w維素酶解
稱取0.50 g絕干Fenton氧化預(yù)處理后楊木置于50 mL潔凈三角瓶?jī)?nèi)，纖維素酶加入量為25 FPU/g。使用pH值為4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（CH3COOHCH3COONa，0.2 mol/L）配置纖維素酶溶液，并加入1 g/L疊氮鈉抑制微生物的生長(zhǎng)。將三角瓶移入ZHWY-2112B搖床中（上海市智誠(chéng)分析儀器有限公司），反應(yīng)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，反應(yīng)72 h后取一定量的酶解液，在8000 r/min條件下離心5 min，上清液用于葡萄糖得率分析。
1.3分析方法
1.3.1葡萄糖得率的測(cè)定
采用高效液相儀（日本島津）測(cè)定葡萄糖含量，具體測(cè)定條件為：Aminex HPX-87P色譜柱（美國(guó)Bio-Rad），柱溫65℃，流動(dòng)相為超純水，流速為0.6 mL/min，示差檢測(cè)器，根據(jù)濃度和峰面積繪制葡萄糖（色譜純）標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測(cè)出的葡萄糖質(zhì)量計(jì)算葡萄糖得率，見(jiàn)式（2）。
式中，C為葡萄糖得率，%；0.50為Fenton氧化預(yù)處理后的楊木取樣絕干質(zhì)量，g；m3為Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅久附獾玫降钠咸烟琴|(zhì)量，g。
1.3.2成分分析
木質(zhì)纖維原料的成分分析測(cè)定按照文獻(xiàn)［16］描述的方法進(jìn)行。本研究所用楊木的成分分析結(jié)果如表2所示。
表2 楊木成分分析 %
1.3.3X射線衍射（XRD）分析
采用XRD（荷蘭帕納科銳影）檢測(cè)Fenton氧化預(yù)處理前后楊木的結(jié)晶度，掃描范圍為2θ=10°～50°。
1.3.4比表面積分析
采用ASAP2020物理吸附儀（美國(guó)麥克瑞默爾公司），根據(jù)氣體吸附BET法測(cè)定樣品的比表面積，測(cè)定條件為：脫氣溫度50℃，脫氣時(shí)間8 h。具體步驟參見(jiàn)GB/T 19587—2004。
1.3.5掃描電子顯微鏡（SEM）分析
采用SU8010 SEM（日本日立）觀察Fenton氧化預(yù)處理前后楊木的微觀形態(tài)，測(cè)試前對(duì)樣品進(jìn)行鍍金處理。
2 結(jié)果與討論
2.1單因素實(shí)驗(yàn)
研究H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度對(duì)Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅酒咸烟堑寐实挠绊懀Y(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著預(yù)處理液中H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度的增大，葡萄糖得率都呈先上升后下降的趨勢(shì)，這一結(jié)果與前期其他研究者得到的結(jié)果一致。結(jié)果表明，當(dāng)Fe3+濃度達(dá)到一定值后，繼續(xù)增加Fe3+的濃度會(huì)抑制纖維素酶的活性［10］；此外，高于或低于最佳pH值也會(huì)影響Fenton氧化反應(yīng)［17］。綜上，H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度的最佳值分別為10%、2.5和50 mmol/L。
圖1 H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3濃度對(duì)Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅酒咸烟堑寐实挠绊?/p>
2.2中心組合實(shí)驗(yàn)
為了驗(yàn)證單因素實(shí)驗(yàn)得出的Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜淖罴褩l件（H2O2/FeCl3=10%，pH值2.5，F(xiàn)eCl3濃度50 mmol/L），設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)對(duì)這一條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。將最佳條件作為中心點(diǎn)條件代入表1中得到所有的預(yù)處理?xiàng)l件，具體條件及結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅局行慕M合實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果
從表3可以看出，楊木經(jīng)Fenton氧化預(yù)處理后得率相差不大，基本都在80%～95%，表明與其他方法相比，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理可以獲得更高的預(yù)處理得率［1，18］。H2O2作為一種強(qiáng)氧化劑，可以氧化脫除木質(zhì)纖維原料中的組分；由表3可知，當(dāng)H2O2/FeCl3為5%時(shí)，其預(yù)處理得率較H2O2/FeCl3為10%和15%時(shí)高，說(shuō)明在Fenton氧化反應(yīng)中，過(guò)量的H2O2會(huì)導(dǎo)致纖維素纖維的降解［8］，反而使預(yù)處理得率降低。在酸性條件下，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理可產(chǎn)生高度活性的·OH，因此pH值對(duì)Fenton氧化預(yù)處理也有較大影響。對(duì)比11#、12#和15#3組預(yù)處理?xiàng)l件可以發(fā)現(xiàn)，在其他條件相同時(shí)，改變Fenton氧化預(yù)處理的pH值對(duì)預(yù)處理得率的影響不大，但總的趨勢(shì)是隨著pH值的提高，預(yù)處理得率下降。葡萄糖得率受pH值影響較大，當(dāng)pH值為2.0和3.0時(shí)，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理?xiàng)钅酒咸烟堑寐蕛H為約20%，而pH值為2.5時(shí)，葡萄糖得率可增至50%以上，說(shuō)明在這一pH值條件下，體系中參與Fenton氧化的Fe3+濃度達(dá)到了最大值［19］。以上結(jié)果說(shuō)明，以預(yù)處理得率和葡萄糖得率為依據(jù)，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜淖罴褩l件為H2O2/FeCl3=10%，pH值2.5，F(xiàn)eCl3濃度50 mmol/L。
2.3響應(yīng)面分析
2.3.1響應(yīng)面法分析Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)葡萄糖得率的影響
根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)，運(yùn)用軟件STATISTICA10.0繪制Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)l件與葡萄糖得率之間的關(guān)系圖，結(jié)果如圖2所示。
圖2 Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)葡萄糖得率影響的響應(yīng)面圖
從圖2可以看出，隨著H2O2/FeCl3、pH值、FeCl3濃度的逐漸增大，葡萄糖得率呈先增大后下降的趨勢(shì)，在響應(yīng)面的中心點(diǎn)出現(xiàn)一個(gè)最大值，即在中心點(diǎn)處葡萄糖得率最大。在中心點(diǎn)條件下，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理?xiàng)钅酒咸烟堑寐士蛇_(dá)51.4%。這一葡萄糖得率是基于初始原料質(zhì)量計(jì)算得到的，如果以原料中聚葡萄糖含量為基準(zhǔn)（理論值100%）計(jì)算，在中心點(diǎn)條件下，葡萄糖得率可高達(dá)理論值的94.7%，遠(yuǎn)高于其他預(yù)處理方法［1，20-23］，說(shuō)明Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅究色@得較高的葡萄糖得率。
用軟件Minitab17分析Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)葡萄糖得率的影響可知，H2O2/FeCl3對(duì)葡萄糖得率影響的p值為0.445（p＞0.1），pH值對(duì)葡糖得率影響的p值為0.157（p＞0.1），這兩者p值均大于0.1，說(shuō)明H2O2/FeCl3和pH值對(duì)葡萄糖得率無(wú)顯著性影響。而FeCl3濃度對(duì)葡萄糖得率影響的p值為0.035（p＜0.05），由此可知，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理?xiàng)钅緯r(shí)，F(xiàn)eCl3濃度對(duì)葡萄糖得率的影響最顯著。
2.3.2Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)脫木質(zhì)素的影響
研究表明，木質(zhì)素的脫除可以顯著增加木質(zhì)纖維原料的酶解得率，因?yàn)槟举|(zhì)素會(huì)在酶解過(guò)程中對(duì)纖維素酶造成無(wú)效吸附而降低有效酶活［24-25］。有研究表明，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理可改變木質(zhì)纖維原料中木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)而增加其酶解效率［7］，因此本研究測(cè)定了不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)楊木脫木質(zhì)素的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)楊木脫木質(zhì)素的影響
從表4可以看出，經(jīng)Fenton氧化預(yù)處理過(guò)后，楊木中的木質(zhì)素有不同程度的脫除。2#預(yù)處理?xiàng)l件下木質(zhì)素脫除率最高，為35.6%；而1#預(yù)處理?xiàng)l件下，楊木木質(zhì)素脫除率不到1%。在最佳預(yù)處理?xiàng)l件（15#）下，木質(zhì)素脫除率為26.1%。雖然前期的研究［26］表明，木質(zhì)素的脫除有利于纖維素酶解效率的提高，但在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，并未發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素脫除率與葡萄糖得率的直接相關(guān)性，說(shuō)明Fenton氧化預(yù)處理提高木質(zhì)纖維原料的酶解效率不僅在于木質(zhì)素的脫除，可能還包括原料其他性質(zhì)的變化，如纖維素結(jié)晶度和纖維素聚合度等的改變。
用軟件Minitab17分析Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)楊木脫木質(zhì)素的影響可知，H2O2/FeCl3對(duì)楊木脫木質(zhì)素影響的p值為0.012（p＜0.05），pH值對(duì)楊木脫木質(zhì)素影響的p值為0.846（p＞0.1），F(xiàn)eCl3濃度對(duì)楊木脫木質(zhì)素影響的p值為0.324（p＞0.1），由此可知，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理?xiàng)钅緯r(shí)，H2O2/FeCl3對(duì)脫木質(zhì)素影響最顯著。
2.4Fenton氧化預(yù)處理對(duì)楊木性能的影響
2.4.1Fenton氧化預(yù)處理對(duì)楊木纖維素結(jié)晶度的影響
有研究結(jié)果表明，木質(zhì)纖維原料的纖維素結(jié)晶度對(duì)其酶解性可能有較大的影響，因?yàn)闊o(wú)定形區(qū)較結(jié)晶區(qū)更容易被酶解。但其他相關(guān)研究［27-28］也表明，對(duì)于預(yù)處理后的木質(zhì)纖維原料來(lái)說(shuō)，纖維素結(jié)晶度對(duì)其酶解性能可能沒(méi)有影響。Fenton氧化預(yù)處理前后楊木的XRD譜圖如圖3所示。由圖3可知，楊木的XRD譜圖呈典型的纖維結(jié)構(gòu)特征。由計(jì)算得到，F(xiàn)enton氧化預(yù)處理前楊木的纖維素結(jié)晶度為39.9%，經(jīng)最佳預(yù)處理?xiàng)l件處理后，楊木的纖維素結(jié)晶度上升至45.0%，較預(yù)處理前提高了12.8%。預(yù)處理后木質(zhì)纖維原料的纖維素結(jié)晶度提高在其他研究中也有報(bào)道［28-30］。纖維素結(jié)晶度的提高說(shuō)明Fenton氧化預(yù)處理主要破壞了楊木纖維中的纖維素?zé)o定形區(qū)，脫除了部分半纖維素和木質(zhì)素［6］；此外，也可能是纖維素發(fā)生氫鍵重排，造成重結(jié)晶現(xiàn)象導(dǎo)致的。
圖3 Fenton氧化預(yù)處理前后楊木的XRD譜圖
2.4.2Fenton氧化預(yù)處理對(duì)楊木比表面積的影響
本研究采用氣體吸附BET法測(cè)定了Fenton氧化預(yù)處理前后楊木的比表面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，楊木的比表面積由預(yù)處理前的0.91 m2/g增加到預(yù)處理后的1.63 m2/g（最佳預(yù)處理?xiàng)l件下），較預(yù)處理前提高了80.2%。比表面積的增加有利于纖維素酶與底物的接觸，可使更多的纖維素被纖維素酶降解為葡萄糖而提高葡萄糖得率。這與其他研究［28-29］得到的結(jié)果一致，即木質(zhì)纖維原料經(jīng)預(yù)處理后，其比表面積的增大與其纖維素轉(zhuǎn)化率的增加有正相關(guān)關(guān)系。
2.4.3Fenton氧化預(yù)處理對(duì)楊木表面形態(tài)的影響
Fenton氧化預(yù)處理前后楊木的SEM圖如圖4所示。從圖4可以看出，未經(jīng)過(guò)預(yù)處理的楊木，其表面平滑、致密有序，說(shuō)明細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素相互交織在一起。Fenton氧化預(yù)處理后的楊木表面變得比較粗糙，有裂痕以及孔洞的存在，結(jié)構(gòu)變得松散。另外，楊木的表面出現(xiàn)了大量的凹陷和裂痕，這在一定程度上提高了物料的比表面積，增加了纖維素酶分子與纖維素的接觸位點(diǎn)，從而促進(jìn)纖維素酶對(duì)纖維素的降解。
綜上可知，經(jīng)Fenton氧化預(yù)處理后，楊木的纖維素結(jié)晶度提高，比表面積增加，且結(jié)構(gòu)變得粗糙松散。其中，楊木比表面積的增大和結(jié)構(gòu)的改變可能增加了纖維素酶與纖維素的作用位點(diǎn)和可及度，促進(jìn)了纖維素酶對(duì)楊木纖維的酶解程度，最終提高了葡萄糖得率。
圖4 （a，c）未處理?xiàng)钅竞停╞，d）Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜腟EM圖
3 結(jié)論
以楊木為原料，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)（H2O2/FeCl3（體積比，下同）、pH值和FeCl3濃度）及中心組合-響應(yīng)面法優(yōu)化了Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜淖罴褩l件。采用成分分析、X射線衍射（XRD）、比表面積分析及掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)預(yù)處理前后的楊木進(jìn)行了表征，主要結(jié)論如下。
3.1Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜淖罴褩l件為：H2O2/Fe-Cl3=10%，pH值2.5，F(xiàn)eCl3濃度50 mmol/L。在最佳預(yù)處理?xiàng)l件下，楊木的葡萄糖得率可達(dá)51.4%，為理論值的94.7%。
3.2通過(guò)Minitab17軟件分析得到FeCl3濃度對(duì)Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅酒咸烟堑寐实挠绊懽铒@著，H2O2/FeCl3對(duì)脫木質(zhì)素影響最顯著。
3.3Fenton氧化預(yù)處理過(guò)程中脫除了部分木質(zhì)素，在最佳預(yù)處理?xiàng)l件下，木質(zhì)素脫除率達(dá)到26.1%。Fenton氧化預(yù)處理提高了楊木的纖維素結(jié)晶度（由預(yù)處理前的39.9%提高至45.0%）和比表面積（由預(yù)處理前的0.91 m2/g提高至1.63 m2/g）。楊木比表面積的增大和表面結(jié)構(gòu)的改變促進(jìn)了纖維素的酶降解，提高了Fenton氧化預(yù)處理?xiàng)钅镜钠咸烟堑寐省?/p>
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