齊云賡 馬明帥 郭懷澤 李海明

（遼寧省制漿造紙工程高校重點(diǎn)研究室，大連工業(yè)大學(xué)輕工與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連，116034）

利用生物質(zhì)精煉技術(shù)可將儲(chǔ)量豐富、廉價(jià)、可再生的植物資源轉(zhuǎn)化成生物質(zhì)基的化學(xué)品、材料和燃料等，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)資源利用價(jià)值的最大化，促進(jìn)人類社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展［1］。熱水預(yù)水解技術(shù)可破壞植物生物質(zhì)的天然抗拒性［2］，提高酶及化學(xué)品的可及性［3］，是生物質(zhì)精煉技術(shù)體系中一種以水作為唯一試劑、簡(jiǎn)單且成本低的重要前處理技術(shù)［4-6］。生物質(zhì)在預(yù)水解過程中會(huì)產(chǎn)生很多種醛類和有機(jī)酸類物質(zhì)［7］，己糖類物質(zhì)會(huì)脫水生成5-羥甲基糠醛（5-HMF）［8］。5-HMF是一種重要的平臺(tái)化合物，在合成石油類、高分子類、呋喃類產(chǎn)品以及精細(xì)化學(xué)品等方面的應(yīng)用前景廣泛［9］，且在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域也有特殊的應(yīng)用價(jià)值［10-11］。

目前，對(duì)于5-HMF的檢測(cè)多采用高效液相色譜（HPLC）法［12-16］，其原理為樣品首先隨流動(dòng)相泵入色譜柱，然后依次洗脫分離出來，最后通過光譜檢測(cè)器，該檢測(cè)方法存在耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，而且由于檢測(cè)器的限制，只能提供單波長(zhǎng)數(shù)據(jù)；此外，高效液相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法可作為HPLC的補(bǔ)充，如可用于飲料中5-HMF的測(cè)定，然而此類方法檢測(cè)時(shí)，樣品需經(jīng)過提取、凈化、衍生化等較為繁瑣的處理［17］。紫外-可見光分光光度計(jì)（UV-Vis）法也可以用于檢測(cè)5-HMF［18-19］，但預(yù)水解液成分較復(fù)雜，其中的有機(jī)酸類物質(zhì)和酸溶木質(zhì)素等有紫外吸收的物質(zhì)會(huì)降低檢測(cè)的準(zhǔn)確性。超高效液相色譜（UPLC）法的分離原理與HPLC一致，相較于以上傳統(tǒng)方法，其效率更高，洗脫時(shí)間可縮短至HPLC的1/10［20］。二極管陣列檢測(cè)器（PDA）采取多通道并行測(cè)量方式，具有速度快、噪聲小、線性范圍寬、精度高等特點(diǎn)，與色譜聯(lián)用可提供3D數(shù)據(jù)［21］。

本研究以制漿造紙工業(yè)中廣泛使用的桉木為原料進(jìn)行熱水預(yù)水解，并采用UPLC-PDA法檢測(cè)桉木預(yù)水解液中的5-HMF，最后在此基礎(chǔ)上對(duì)桉木熱水預(yù)水解過程中5-HMF的生成規(guī)律進(jìn)行闡述。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

實(shí)驗(yàn)用桉木片購(gòu)自廣西某地，經(jīng)風(fēng)干晾曬，裝袋保存；5-HMF，純度＞98%，美國(guó)Aladdin公司；乙腈，純度＞99.9%，德國(guó)默克公司；超純水，電阻率＞18.2 MΩ·cm。

超高效液相色譜儀（UPLC），ACQUITY UPLC HClass，美國(guó)Waters公司；M/K蒸煮鍋，609-2-10型，美國(guó)M/K公司；超純水發(fā)生器，EASY50，香港Heal Force公司；紫外-可見分光光度計(jì)，CARY 300Conc，美國(guó)VARIAN公司。

1.2 樣品的制備

1.2.1預(yù)水解液的制備

將500 g絕干桉木片和水以液比1∶6加入到M/K蒸煮鍋中，從室溫升溫到設(shè)定溫度（即預(yù)水解溫度），然后保溫一段時(shí)間（即保溫時(shí)間），反應(yīng)結(jié)束后收集預(yù)水解液，置于4℃冰箱中冷藏保存待測(cè)。

1.2.25-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

以超純水為溶劑，配置質(zhì)量濃度為1.2637 mg/L的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)母液，置于4℃冰箱中冷藏保存待測(cè)。對(duì)母液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以獲得一系列不同質(zhì)量濃度的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

1.3 分析檢測(cè)條件

色譜分析采用ACQUITY UPLC?BEH C18分析柱，乙腈/水（20∶80，V/V）為流動(dòng)相，流速為0.2 mL/min，柱溫為40℃，檢測(cè)室溫度為15℃，PDA eλ紫外檢測(cè)器的掃描波長(zhǎng)范圍為190～400 nm。將預(yù)水解液離心處理后，取上層清液并稀釋一定倍數(shù)，經(jīng)0.22μm的水系過濾膜過濾后方可進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 譜圖分析

預(yù)水解溫度180℃、保溫120 min條件下所得桉木預(yù)水解液的UV-Vis光譜圖如圖1所示。從圖1可以看出，桉木預(yù)水解液在277 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，在228和191 nm處亦出現(xiàn)吸收峰。

圖1 180℃、120 min條件下所得桉木預(yù)水解液的UV-Vis光譜圖

圖2 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液的PDA光譜圖

使用UPLC-PDA對(duì)5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行表征，根據(jù)所得色譜圖得知5-HMF的保留時(shí)間為1.520 min，與該保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的PDA光譜圖如圖2所示。從圖2可以看出，5-HMF的特征吸收峰出現(xiàn)在283.55 nm處，另外在228.55和193.55 nm處也有吸收峰，但強(qiáng)度相對(duì)較低，該P(yáng)DA光譜圖與參考文獻(xiàn)［22］中5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液的UV-Vis光譜圖完全吻合。

桉木預(yù)水解液成分復(fù)雜，含有小分子酸、糠醛、呋喃醛、酸溶木質(zhì)素和糖類等物質(zhì)，其中，糠醛、呋喃醛、酸溶木質(zhì)素在280 nm附近均有吸收峰［23］，這些物質(zhì)的存在會(huì)改變光譜吸收峰的位置和形狀，降低UV-Vis法檢測(cè)桉木預(yù)水解液中5-HMF的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，桉木預(yù)水解液中的5-HMF的UPLC-PDA色譜圖與5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液的UPLC-PDA色譜圖、5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液的UV-Vis光譜圖三者峰形和出峰位置一致，表明UPLC-PDA法通過色譜柱的洗脫分離可很好地解決桉木預(yù)水解液中各組分間的相互干擾問題，顯著提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

PDA檢測(cè)器可測(cè)得不同保留時(shí)間的光譜圖，而將特定保留時(shí)間下光譜圖信號(hào)疊加之后，繪制疊加信號(hào)和保留時(shí)間的關(guān)系圖，即可獲得桉木預(yù)水解液的UPLC-PDA色譜圖（見圖3）。由圖3可知，不同保留時(shí)間出現(xiàn)多個(gè)色譜峰，每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)不同的物質(zhì)，再次證明桉木預(yù)水解液成分較為復(fù)雜，同時(shí)也說明多種物質(zhì)已得到有效分離。

圖3 180℃、120 min條件下所得桉木預(yù)水解液的UPLC-PDA色譜圖

圖4 UPLC-PDA法不同保留時(shí)間色譜峰對(duì)應(yīng)的PDA光譜圖

圖4 為UPLC-PDA法不同保留時(shí)間下色譜峰的PDA光譜圖。從圖4可以看出，各組分的特征光譜吸收峰不盡相同，但絕大多數(shù)在283.55 nm處均有吸收（λ=283.55 nm處吸光度A均大于0），如果未經(jīng)UPLC色譜柱分離，這些組分的存在必將對(duì)5-HMF的檢測(cè)造成干擾。

2.2 線性關(guān)系和檢出限

為了考察5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)峰面積的線性關(guān)系，將1.2637 mg/L的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)母液稀釋得到一系列不同質(zhì)量濃度的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后進(jìn)行UPLC-PDA檢測(cè)，得到不同質(zhì)量濃度5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的峰面積，再根據(jù)5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度和峰面積，建立線性回歸方程y=6721.9965x+49.0311，其中，線性范圍為0.0158～3.1593 mg/L，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9998；其檢出限按式（1）計(jì)算［24］。

式中，ρmin為檢出限，μg/L；ρS為樣品質(zhì)量濃度，mg/L；hn為噪音峰高；h為樣品峰高。經(jīng)計(jì)算，5-HMF的檢出限為3.883μg/L。

2.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

為了考察UPLC-PDA法檢測(cè)5-HMF的重現(xiàn)性，將質(zhì)量濃度為1.2637 mg/L的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)母液進(jìn)行連續(xù)進(jìn)樣5次重復(fù)檢測(cè)，測(cè)得的質(zhì)量濃度分別為1.2359、1.2400、1.2382、1.2435和1.2393 mg/L，計(jì)算得出5次檢測(cè)結(jié)果的平均值（X）為1.2393 mg/L和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.2%?？梢姡琔PLC-PDA法的重現(xiàn)性較好。

2.4 5-HMF回收率測(cè)試

將1.2637 mg/L的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)母液加入到預(yù)水解溫度180℃、保溫時(shí)間120 min條件下所得的桉木預(yù)水解液中，以進(jìn)行5-HMF回收率的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而考察UPLC-PDA法的檢測(cè)準(zhǔn)確性。5-HMF加標(biāo)回收率（R，%）按式（2）計(jì)算。

式中，ρ1表示所加入5-HMF標(biāo)準(zhǔn)母液的質(zhì)量濃度，mg/L；ρ2表示桉木預(yù)水解液中5-HMF的質(zhì)量濃度，mg/L；ρ3表示加標(biāo)后所測(cè)得的5-HMF質(zhì)量濃度，mg/L。ρ1、ρ2和ρ3分別為1.2637、2.5284、3.8573 mg/L，經(jīng)計(jì)算得到5-HMF加標(biāo)回收率為105.2%，說明UPLC-PDA法檢測(cè)的準(zhǔn)確性較高。

2.5 桉木預(yù)水解過程5-HMF的生成規(guī)律

桉木中含有半乳糖基、甘露糖基和葡萄糖基等己糖類的糖基，其中半乳糖基含量2.54%（以半乳糖表示），甘露糖基含量4.90%（以甘露糖表示），葡萄糖基含量46.24%（以葡萄糖表示）。在桉木預(yù)水解過程中，半乳糖最先溶出，其次為甘露糖，最后為葡萄糖；在一定條件下，這些己糖會(huì)發(fā)生脫水反應(yīng)生成5-HMF［25］，因此實(shí)時(shí)監(jiān)控桉木預(yù)水解液中5-HMF的含量可輔助判斷預(yù)水解過程中纖維素的降解程度，同時(shí)為分離和利用5-HMF提供指導(dǎo)。利用UPLC-PDA法對(duì)不同預(yù)水解條件下所得桉木預(yù)水解液中5-HMF進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同預(yù)水解條件下所得桉木預(yù)水解液中5-HMF質(zhì)量濃度的變化規(guī)律

由圖5可以看出，預(yù)水解溫度和保溫時(shí)間均對(duì)5-HMF生成的影響顯著。當(dāng)保溫時(shí)間為30 min時(shí)，隨著預(yù)水解溫度的提升，桉木預(yù)水解液中的5-HMF從無到有，并且生成量逐漸增多。預(yù)水解溫度不高于170℃時(shí)，存在保溫時(shí)間效應(yīng)（即隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，桉木預(yù)水解液中5-HMF的含量逐漸增加），且隨著預(yù)水解溫度的提升，保溫時(shí)間效應(yīng)增強(qiáng)。預(yù)水解溫度為180℃時(shí)，總體上仍然存在保溫時(shí)間效應(yīng)，但是保溫90 min時(shí)，桉木預(yù)水解液中5-HMF的含量略有下降，造成這種現(xiàn)象的原因可能是60 min之前，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，己糖脫水生成5-HMF的速度加快，此過程中桉木預(yù)水解液pH值逐漸下降，保溫時(shí)間延長(zhǎng)至90 min時(shí)，由于此時(shí)體系的pH值、液相成分的比例以及固相孔隙結(jié)構(gòu)等因素可能處于一種臨界狀態(tài)，使得5-HMF不再穩(wěn)定，進(jìn)一步發(fā)生降解生成乙酰丙酸、甲酸［26］或碳微球［27］，導(dǎo)致5-HMF的分解速率高于生成速率，因而體系中其含量略有下降，后期隨著保溫時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，固相孔隙結(jié)構(gòu)、液相成分和pH值發(fā)生變化，利于己糖脫水生成5-HMF，最終表現(xiàn)為保溫時(shí)間120 min時(shí)5-HMF含量進(jìn)一步增加。

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（UPLCPDA）法對(duì)桉木熱水預(yù)水解液中5-羥甲基糠醛（5-HMF）進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件如下：采用BEH C18分析柱，乙腈/水（20∶80，V/V）為流動(dòng)相，流速為0.2 mL/min，柱溫為40℃；采用PDA檢測(cè)器，掃描范圍為190～400 nm，定量波長(zhǎng)為283.55 nm。5-HMF質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程y=6721.9965x+49.0311，線性范圍為0.0158～3.1593 mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.9998，檢出限為3.883μg/L，重現(xiàn)檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%，加標(biāo)回收率為105.2%。該方法具有穩(wěn)定性高、分析速度快、線性相關(guān)性和重現(xiàn)性良好的特點(diǎn)，為快速分析植物生物質(zhì)中的5-HMF提供了一定的理論依據(jù)。通過對(duì)桉木熱水預(yù)水解液中5-HMF的準(zhǔn)確定量分析發(fā)現(xiàn)，保溫時(shí)間和預(yù)水解溫度是影響桉木預(yù)水解液中5-HMF生成的2個(gè)重要因素。在預(yù)水解溫度足夠高和保溫時(shí)間足夠長(zhǎng)的條件下，5-HMF開始生成，隨著保溫時(shí)間的持續(xù)延長(zhǎng)和預(yù)水解溫度的升高，桉木熱水預(yù)水解液中的5-HMF含量總體呈上升趨勢(shì)，且隨著預(yù)水解溫度的升高，保溫時(shí)間效應(yīng)增強(qiáng)，這對(duì)調(diào)控預(yù)水解過程中纖維素降解形成葡萄糖及其進(jìn)一步脫水形成5-HMF意義重大。