陳建武，彭婕，甘金華，楊總，張濤，何力*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(武漢)，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所， 湖北 武漢 430223; 2.上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司， 上海 200335)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的稻蝦輪作因綠色養(yǎng)殖、環(huán)境友好的新型養(yǎng)殖模式，可實現(xiàn)種養(yǎng)共生互利，增產(chǎn)增收的優(yōu)勢而被廣泛推廣。但同時，稻田以及蝦塘周邊農(nóng)作物耕種過程中因所施用農(nóng)藥對稻田養(yǎng)蝦的食用安全性而備受關(guān)注。在農(nóng)作物生產(chǎn)中施用的除草劑、殺菌劑和殺蟲劑等污染物存在由周圍環(huán)境經(jīng)排放灌溉、雨水徑流等方式進(jìn)入養(yǎng)殖水體等的現(xiàn)象，因其具有復(fù)雜和不確定性，給水產(chǎn)品食用安全性帶來風(fēng)險，已成為稻蝦養(yǎng)殖模式下水產(chǎn)品質(zhì)量安全的一大隱患和關(guān)注焦點[1-5]。有研究報道，多種農(nóng)藥極易通過雨水徑流等方式流入水生系統(tǒng)中，在農(nóng)作物周邊水生態(tài)系統(tǒng)中常有檢出[1-2，6-7]。

三環(huán)唑(tricycalzole)為中等毒性的內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，主要用于水稻稻瘟病防治，在水稻種植中被廣泛應(yīng)用[8-10]。三環(huán)唑?qū)儆诘投拘缘霓r(nóng)用殺菌劑。有研究報道，三環(huán)唑?qū)λ鷳B(tài)系統(tǒng)具有潛在的風(fēng)險[6-7，11]，人體中毒后也會引起不同程度的不適癥狀[12]。三環(huán)唑在中國水產(chǎn)品中沒有相關(guān)限量的要求[13]，在水產(chǎn)品的殘留研究也少有報告[4]。目前，對三環(huán)唑的殘留檢測研究大都集中在農(nóng)作物及其耕作土壤中，多采用高效液相色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等檢測方法[8-10，12-16]檢測。近年來也有用超高效液相串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜法或氣相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜法非靶向篩查糧谷中的農(nóng)藥殘留，并檢測到三環(huán)唑[3，17-19]的報道。克氏原螯蝦中三環(huán)唑的篩查與檢測方法尚未見報道，僅有通過靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜對水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的篩查[4]和通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對克氏原螯蝦中的二甲戊靈殘留的檢測方法的研究報道[5]。以四級桿飛行時間質(zhì)譜為代表的高分辨質(zhì)譜分析檢測技術(shù)具有較寬的掃描范圍，較高的特異性、高質(zhì)量準(zhǔn)確度和高分辨率等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測領(lǐng)域中的對農(nóng)獸藥殘留的靶向和非靶向定性定量分析[3，4，17-27]。本研究采用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜對克氏原螯蝦肌肉中三環(huán)唑的殘留進(jìn)行靶向快速篩查，并借鑒有關(guān)文獻(xiàn)方法，采用溶劑提取、QuEChERS前處理方法進(jìn)行了定量分析，以期為檢測克氏原螯蝦中的三環(huán)唑殘留提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

美國Agilent UPLC 1290串聯(lián)QTOF 5600+(美國SCIEX公司)(配有MultiQuant3.0.2和MasterView?2.2數(shù)據(jù)采集分析軟件)；分析天平(梅特勒-托利多 PL202-L)；超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)SK5210LHC)；旋蒸儀(鞏義市予華儀器RE-2000E)；渦旋振蕩儀(SCILOG MX-F)；離心機(jī)(Sigma 3K15)。

三環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.6%，DR公司)；甲醇、乙腈及甲酸(均為JT Baker公司，色譜級)；無水硫酸鎂和氯化鈉(國藥集團(tuán)，分析純)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

克氏原鰲蝦剝殼去頭、內(nèi)臟并拔掉腸腺后，取肌肉部分處理成小于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊，混勻，用高速絞肉機(jī)充分?jǐn)嚿⒕鶆?，用密封袋封好，?biāo)記并于-18 ℃冷凍備存。

1.2.2 提取

1.2.2.1 靶向篩查分析前處理

參照文獻(xiàn)[4，22]進(jìn)行前處理方法優(yōu)化，并稍作修改。本篩查方法步驟如下：稱取5 g(±0.01 g)肌肉于50 mL具塞離心管中，25 mL乙腈(含0.1%甲酸，V/V)提取，渦旋2 min，超聲5 min，6 000 r/min離心5 min，重復(fù)上述步驟提取一次，合并上清液轉(zhuǎn)移至125 mL雞心瓶中，40 ℃減壓旋蒸至近干，用1 mL的50%甲醇(含 0.1%甲酸)振蕩超聲溶解，過0.22 μm有機(jī)濾膜上機(jī)。

1.2.2.2 定量分析前處理

參照文獻(xiàn)[4，14-17，22-23]，優(yōu)化了樣品前處理方法：稱取2.00 g(±0.01 g)肌肉于50 mL具塞離心管中，加入25 mL乙腈(0.1%甲酸)后渦旋振蕩1 min后，加入3 g無水硫酸鎂、2 g氯化鈉，渦旋2 min，超聲5 min，6 000 rpm離心后，上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶，乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液，40 ℃減壓旋蒸至近干，用乙腈-水(1∶1,V/V)1 mL 復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入20 mg的石墨碳化黑(GCB)和50 mg的酸性氧化鋁(AL-A)后，渦旋混勻后超速離心，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜上機(jī)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量的三環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃冰箱中避光保存；用甲醇-水(1∶1,V/V)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL、0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于-18 ℃避光保存。根據(jù)需要，吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用水稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、2.0、10.0、20.0、50.0和100.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。根據(jù)需要，采用前文1.2.2.2節(jié)前處理方法處理空白克氏原螯蝦樣品，制備得到空白樣品溶液，用空白樣品溶液稀釋三環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別配制質(zhì)量濃度為0.5、2.0、10.0、20.0、50.0和100.0 ng/mL的系列空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫30 ℃，流速為0.3 mL/min，流動相A為0.1%甲酸(V/V)， B為甲醇。靶向篩查梯度洗脫程序：0～2 min，95% A；2～20 min，90%～5%A；20～28 min，5%A；28.1～35.0 min，90%A；進(jìn)樣量為20 μL。定量分析梯度洗脫程序：0～0.5 min，95% A；0.5～2 min，95%～85%A；2～5 min，85%～5%A；5～7 min，5%A；7.1～10 min，95%A；進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

靶向篩查質(zhì)譜條件：DuoSprayTM離子源，電噴霧電離(ESI)，正離子模式掃描，離子源溫度為550 ℃；噴霧電壓為5 500 V，去簇電壓(DP)為80 V；霧化氣(GS1)為45 psi；輔助霧化氣(GS2)為45 psi；氣簾氣(CUR)為30 psi。積累時間為0.25 s，信息依賴性掃描(IDA)模式；IDA觸發(fā)15個子離子掃描；碰撞電壓為(35±15)eV，TOF MS進(jìn)行全掃描，TOF MS /MS進(jìn)行二級子離子掃描。

定量分析質(zhì)譜條件：DuoSprayTM離子源，電噴霧電離(ESI)，正離子模式掃描，離子源溫度為550 ℃；噴霧電壓為5 500 V； GS1為45 psi； GS2為45 psi； CUR為30 psi；積累時間為0.25 s，采用MRMHR掃描，根據(jù)靶向篩查和質(zhì)譜優(yōu)化結(jié)果選擇高靈敏模式來監(jiān)測三環(huán)唑特征峰(190.0/ 136.0*，190.0/163.0，*為定量離子)，去簇電壓為89 V，碰撞能為32 eV。

1.2.5 三環(huán)唑本地標(biāo)準(zhǔn)庫建立及靶向篩查方法

將質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的三環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)中間溶液經(jīng)色譜柱分離后，在飛行時間質(zhì)譜中進(jìn)行全掃描(范圍為100～1 000 Da)，并進(jìn)行一定碰撞能范圍內(nèi)(±15 eV)的一級、二級離子碎片掃描，得到[M+H]+準(zhǔn)分子離子和碎片離子的精確分子量，結(jié)合文獻(xiàn)以及一級、二級圖譜中的TIC圖，在IDA圖譜中找到碎片的精確分子量，色譜保留時間，同時將化合物名稱、結(jié)構(gòu)式、分子式和美國化學(xué)文摘登記號(CAS)等信息導(dǎo)入譜圖文庫，建立三環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)圖譜，并用CSV格式輸出保存，建立三環(huán)唑目標(biāo)物靶向快速篩查的標(biāo)準(zhǔn)庫。

儀器篩查方法的檢索參數(shù)包括精確質(zhì)量數(shù)偏差小于5 ppm(5.0×10-6)，信噪比小于3，峰響應(yīng)閾值強(qiáng)度為2.0×103，同位素比值偏差小于20%，將前文1.2.2.1前處理樣品采集信息和本地標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫比較，設(shè)置靶向篩查權(quán)重因子(質(zhì)量偏差因子0.3，同位素比值偏差因子為0.3，庫匹配因子為0.4)，綜合得分大于80，并通過二級碎片譜圖匹配比對排除假陽性，視為確證三環(huán)唑陽性樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 三環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)庫圖譜及靶向篩查方法建立

藥物靶向快速篩查主要基于QTOF的高分辨數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫儲存了化合物多方位譜圖信息并進(jìn)行了歸類，但不同的儀器產(chǎn)生的化合物信息及響應(yīng)均有所差異，因此需要建立本地標(biāo)準(zhǔn)庫，圖1為本地標(biāo)準(zhǔn)品庫中三環(huán)唑的提取離子流色譜圖。將三環(huán)唑化合物名稱、結(jié)構(gòu)式、分子式、精確分子量、CAS號及碎片離子精確質(zhì)量數(shù)等所有相關(guān)信息導(dǎo)入本地專屬三環(huán)唑數(shù)據(jù)庫，并存儲三環(huán)唑二級碎片離子譜圖信息，結(jié)合MasterView定性篩查分析軟件，用于和克氏原螯蝦基質(zhì)樣品的一級、二級譜圖相似度匹配。導(dǎo)入三環(huán)唑本地標(biāo)準(zhǔn)(后綴名.csv)，為降低檢索數(shù)據(jù)量和復(fù)雜程度，加快匹配速度并提高準(zhǔn)確性，按前文1.2.5中所述方法設(shè)置目標(biāo)物檢索參數(shù)，對目標(biāo)物進(jìn)行靶向快速確證。圖2為克氏原螯蝦基質(zhì)添加三環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液后的提取離子流圖和一級、二級譜圖對比圖。

靶向篩查基于高分辨數(shù)據(jù)庫，該庫存儲了專屬化合物多方位信息。通過高分辨數(shù)據(jù)庫結(jié)合化合物信息篩查對比確證功能的MasterView軟件分析，利用專屬庫以及Library中存儲的一定碰撞能下的二級質(zhì)譜圖，用于一級、二級譜圖相似度鏡像比對(圖2)，能提供更有利的匹配條件，減少假陽性。通過前述檢索參數(shù)設(shè)置，提高了篩查速度和篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性。經(jīng)過對比，最終實際分析中的精確質(zhì)量數(shù)偏差為2 ppm，與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間差小于0.5min，MasterView軟件計算綜合得分在90.9左右，與標(biāo)準(zhǔn)品的二級碎片離子圖譜質(zhì)匹配比對通過，因此，確證通過，可進(jìn)行下一步的定量分析。

2.2 定量分析方法

在建立三環(huán)唑本地譜圖庫后并與陽性樣品篩查匹配時(圖2)，發(fā)現(xiàn)三環(huán)唑有3個響應(yīng)值較高的子離子，分別為(m/z)163.0，(m/z)136.0，(m/z)109.0，其中(m/z)136.0響應(yīng)值最高，且相對特異性較高，因此選擇(m/z)136.0作為定量離子，次高的為定性離子(m/z163.0)。

QTOF的靶向掃描模式可以通過質(zhì)譜優(yōu)化和高分辨率下MRM方法實現(xiàn)對農(nóng)藥污染物的定量檢測。雖然缺乏凈化步驟的前處理可以避免化合物漏檢，但對于準(zhǔn)確定量測定，需解決水產(chǎn)品基質(zhì)干擾嚴(yán)重，檢測靈敏度較低的問題[4，28]。克氏原螯蝦肌肉中含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，基質(zhì)復(fù)雜，直接提取的回收率不理想，背景噪音也較高[4，28]，因此需要在提取后進(jìn)行凈化處理由于乙腈對三環(huán)唑具有良好的溶解性，且能沉淀部分蛋白質(zhì)，因此直接采用乙腈進(jìn)行提取，可避免漏檢三環(huán)唑[4]。參考相關(guān)文獻(xiàn)，按前文1.2.2.2前處理所述方法，本實驗酸化乙腈提取之后，依次采用無水硫酸鎂除水，飽和氯化鈉鹽析去除蛋白質(zhì)，石墨碳化黑和酸性氧化鋁去除克氏原螯蝦肌肉中色素和脂肪后，采用MRMHM模式對克氏原螯蝦肌肉中的三環(huán)唑中進(jìn)行定量分析。將空白基質(zhì)匹配的體積濃度分別為0.5、2.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L 三環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，以MRMHM監(jiān)測(190.0/136.0)定量離子的峰面積為橫坐標(biāo)，溶液濃度為縱坐標(biāo)，采用MultiQuant 3.0.2軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=694.34X+ 29.16，r=0.999 5。以3倍信噪比時的檢測含量為檢出限(LOD)，結(jié)果為0.5 μg/kg，定量限(LOQ)為1.0 μg/kg。上述結(jié)果表明QuEChERS方法能快速凈化和除脂，線性相關(guān)良好，檢測限較低，能滿足檢測要求。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

在優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)下，按1.2.3所述，用三環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液配置克氏原螯蝦的系列空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比(M)評價基質(zhì)效應(yīng)[10]，比值越接近1，說明基質(zhì)效應(yīng)越小。結(jié)果表明，三環(huán)唑在克氏原螯蝦肌肉中的基質(zhì)效應(yīng)(M)為0.34，存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，最終采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2.4 回收率和精密度

以不含三環(huán)唑的空白克氏原螯蝦肌肉為基質(zhì)，采用基質(zhì)加標(biāo)法評價回收率和精密度。添加水平分別為0.5、10.0和20.0 μg/kg，每個水平重復(fù)6次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個添加水平的回收率為65.15%～94.24%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.31%～8.12%，其回收率和精密度均滿足克氏原螯蝦中三環(huán)唑殘留檢測要求。圖3為空白基質(zhì)添加水平為10.0 μg/kg的三環(huán)唑MRM色譜圖。

2.5 實際樣品測定

采用建立的快速靶向篩查方法對實驗室2018年采集自稻田養(yǎng)魚塘的重點水產(chǎn)品中的79個克氏原螯蝦樣品中的三環(huán)唑進(jìn)行快速靶向篩查，對克氏原螯蝦樣品按前文1.2.2.1經(jīng)通用前處理后，與三環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品的高分辨二級碎片譜圖數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，其質(zhì)量數(shù)偏差小于5 ppm，譜圖匹配度綜合得分在80～100之間，通過二級碎片譜圖比對后排除假陽性后，即可定性通過為陽性樣品。同時克氏原螯蝦樣品按照前文1.2.2.2經(jīng)提取、凈化后，采用定量分析方法測定，結(jié)果均沒有三環(huán)唑檢出。郭思言等[4]對水產(chǎn)批發(fā)和零售市場上的水產(chǎn)樣品進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)樣品中三環(huán)唑的檢出率為1.2%，但檢測對象沒有涉及克氏原螯蝦。本實驗檢測的克氏原螯蝦樣品均抽檢自水質(zhì)良好的稻田養(yǎng)蝦塘，稻田養(yǎng)蝦采取的是“蝦稻共生”的綠色生態(tài)種養(yǎng)模式，即在一季稻田里養(yǎng)殖小龍蝦，蝦為稻“除草、松土、增肥”，稻為蝦“供餌、遮陰、避害”。因此，三環(huán)唑的施撒行為可能性很少，實驗室采樣過程中調(diào)查采訪抽樣對象得知種稻養(yǎng)蝦過程中沒有使用三環(huán)唑，所以該年度所抽檢的克氏原螯蝦樣品沒有檢測出三環(huán)唑。

3 結(jié)論

高分辨飛行時間質(zhì)譜儀對陽性樣品的定向篩查較為準(zhǔn)確和快速，而經(jīng)過定量方法優(yōu)化后UPLC-QTOF-MS/MS對一些農(nóng)藥污染物的定量分析能力并不遜色于液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀，遠(yuǎn)高于液相檢測方法。本研究建立的基于UPLC-QTOF/MS法快速靶向篩查與測定克氏原螯蝦中的三環(huán)唑方法，通過自建的本地專屬三環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫和Library庫，結(jié)合MasterView篩查軟件對克氏原螯蝦中的三環(huán)唑進(jìn)行靶向快速篩查分析并確證，并在此基礎(chǔ)上采用QuEChERS方法對三環(huán)唑進(jìn)行定量，并對稻田養(yǎng)蝦塘中的克氏原螯蝦抽檢樣品進(jìn)行了測定。本方法篩查快速準(zhǔn)確，定量檢測的LOD、LOQ及回收率均能滿足三環(huán)唑的檢測要求，因此可用于克氏原螯蝦可食肌肉中三環(huán)唑的快速靶向篩查和定量分析，同時也可為水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的快速篩查和定量檢測提供參考。