吳小延，李丹，楊鑫華，劉小云，龍亞康，王芳，鄧玲

510060 廣州，中山大學(xué)腫瘤防治中心，華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(吳小延、楊鑫華、劉小云、龍亞康、王芳、鄧玲);510095廣州，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科(李丹)

近年來(lái)，隨著國(guó)家大力推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療計(jì)劃，高通量測(cè)序技術(shù)在臨床檢測(cè)應(yīng)用上取得極大的發(fā)展，其應(yīng)用已擴(kuò)展至腫瘤個(gè)體化治療、遺傳疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、傳染性疾病基因及心血管疾病等其他復(fù)雜疾病的臨床診斷和治療中，檢測(cè)范圍涵蓋各個(gè)領(lǐng)域[1-8]。然而，高通量測(cè)序技術(shù)作為一種快速崛起的新技術(shù)，目前尚缺乏系統(tǒng)性的法規(guī)或指南來(lái)規(guī)范高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)項(xiàng)目的開(kāi)展，只能參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)會(huì)已出臺(tái)的零散的相關(guān)共識(shí)與指南[9-14]。高通量測(cè)序技術(shù)是由許多細(xì)小過(guò)程聯(lián)結(jié)或嵌套組成的一個(gè)極為復(fù)雜的檢測(cè)過(guò)程，由于該技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作步驟較多，檢測(cè)流程復(fù)雜，數(shù)據(jù)信息量大等因素，故需要進(jìn)行合理的質(zhì)量控制才能使檢測(cè)質(zhì)量達(dá)到既定要求[15-17]。國(guó)內(nèi)高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)多，設(shè)計(jì)Panel的大小及檢測(cè)基因類型均有差別，因此，對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行質(zhì)量控制已經(jīng)成為臨床實(shí)驗(yàn)室迫切的需求和面臨的巨大挑戰(zhàn)[10,18-19]。為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和可靠性，應(yīng)建立具體的規(guī)范化的檢測(cè)流程與增加必要的內(nèi)部質(zhì)量控制方案，來(lái)及時(shí)發(fā)現(xiàn)及把控檢測(cè)過(guò)程中存在的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。因此將質(zhì)控樣本和臨床樣本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)可保證檢測(cè)過(guò)程的有效性。本研究利用Illumina NextSeq500平臺(tái)，人多基因突變檢測(cè)通用試劑盒(燃石醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，295 Panel)，結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)室的建庫(kù)流程，對(duì)攜帶表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、間變淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor,KIT)和大鼠內(nèi)瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)4種已知基因及7種突變類型樣本，按比例混合稀釋成基因突變頻率均為5.00%和2.50%的兩個(gè)質(zhì)控品，通過(guò)對(duì)質(zhì)控品特異性、均一性及穩(wěn)定性的高通量檢測(cè)結(jié)果差異對(duì)比分析,以期使高通量測(cè)序技術(shù)流程更穩(wěn)定，結(jié)果更可靠。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集中山大學(xué)腫瘤防治中心分子診斷科標(biāo)本庫(kù)經(jīng)過(guò)燃石醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，295 Panel高通量檢測(cè)已知EGFR、ALK、KIT和KRAS基因突變類型及野生型的福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)組織樣本，并通過(guò)蘇州吉因加生物醫(yī)學(xué)工程有限公司的人1 021基因突變檢測(cè)試劑盒的高通量測(cè)序法校驗(yàn)其突變，且分別將EGFR、ALK、KIT和KRAS4種基因共7個(gè)突變位點(diǎn)按5.00%、2.50%的突變頻率混入全陰野生型樣本，作為外部質(zhì)控品。

1.2 高通量測(cè)序

常規(guī)石蠟包埋組織切片，根據(jù)HE染色結(jié)果，富集腫瘤細(xì)胞區(qū)域(大于20%)并按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行組織DNA提取(FFPE DNA Kit試劑盒，QIAGENA公司)。利用Illumina公司NextSeq500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，其檢測(cè)流程及工作原理(圖1)為：將基因組DNA經(jīng)超聲波打斷成200 bp左右的片段；進(jìn)行末端修復(fù)加堿基A；加上接頭制備成文庫(kù)。將樣本文庫(kù)加入到測(cè)序芯片上，進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，形成DNA簇，通過(guò)有熒光標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸，進(jìn)行邊合成邊測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用燃石醫(yī)學(xué)有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)化自動(dòng)樣本管理與數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.4 均一性評(píng)價(jià)

為保證質(zhì)控樣本的均一性，將制備好的質(zhì)控品隨機(jī)抽取10支進(jìn)行均一性評(píng)價(jià)，用相同的儀器、試劑及同一人進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

1.5.1短期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)抽取在冷凍條件下(-20℃)保存的5.00%、2.50%的突變質(zhì)控品，做好標(biāo)記，分別放于指定溫度(2℃～8℃、25℃)，每種條件放置10支。從第0周開(kāi)始，每周抽取2支，用高通量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，連續(xù)監(jiān)測(cè)1個(gè)月。

1.5.2長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)抽取置于-20℃冷凍保存的5.00%、2.50%的突變質(zhì)控品2支，用高通量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，每月分別檢測(cè)1次，連續(xù)檢測(cè)12個(gè)月。

1.5.3測(cè)序深度評(píng)價(jià) 將稀釋好的5.00%、2.50%陽(yáng)性質(zhì)控品分別降采樣到3 000×、2 000×、900×、700×、500×、400×、350×、200×，每個(gè)深度分別取3次，然后利用Illumina公司NextSeq500測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，以觀察測(cè)序深度與靈敏度的關(guān)系，進(jìn)一步驗(yàn)證質(zhì)控品的穩(wěn)定性。

圖1 基于捕獲高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)流程

1.6 特異性實(shí)驗(yàn)

采用人多基因突變檢測(cè)通用試劑盒(燃石醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，295 Panel)分別對(duì)5.00%、2.50%的突變質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)中使用相同的劑量，儀器消耗品及同一位操作人員。對(duì)比結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 人1 021基因突變檢測(cè)結(jié)果

本研究對(duì)選取已知EGFR、ALK、KIT和KRAS4種基因突變類型的FFPE腫瘤樣本的人1 021基因突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)情況分析結(jié)果顯示，選取的樣本均攜帶基因突變，共有7種突變類型(包括小片段缺失、插入、點(diǎn)突變和融合)，說(shuō)明選取的臨床樣本含有目的片段，將臨床樣本測(cè)序后證明符合預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體結(jié)果見(jiàn)圖2、表1。

2.2 質(zhì)控品5.00%、2.50%的高通量檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)質(zhì)控品5.00%的高通量測(cè)序結(jié)果分析顯示，共檢出5種基因突變類型(因5.00%突變頻率高，稀釋量超出總體積量，故只選取了5個(gè)突變類型的樣本)，突變頻率在3.70%～5.60%(表2)。通過(guò)對(duì)質(zhì)控品2.50%的高通量測(cè)序結(jié)果分析顯示，共檢出7種基因突變類型，突變頻率在1.90%～3.10%(表2)。

2.3 均一性實(shí)驗(yàn)

對(duì)隨機(jī)抽取的10個(gè)5.00%、2.50%質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控品日內(nèi)重復(fù)性測(cè)定，突變率差異在正常變化范圍內(nèi)，5.00%質(zhì)控品和2.50%質(zhì)控品CV均<10%，從圖3、4所示數(shù)據(jù)可以看出符合質(zhì)控品的日內(nèi)重復(fù)性要求，證明重復(fù)性良好結(jié)果。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

圖2 突變型標(biāo)本和野生型標(biāo)本的高通量測(cè)序結(jié)果

表1 高通量測(cè)序檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本結(jié)果

表2 質(zhì)控品5.00%、2.50%高通量測(cè)序結(jié)果

圖3 5.00%質(zhì)控品的室內(nèi)質(zhì)控日內(nèi)重復(fù)性分析(N=10)

圖4 2.50%質(zhì)控品的室內(nèi)質(zhì)控日內(nèi)重復(fù)性分析(N=10)

圖5 5.00%、2.50%質(zhì)控品不同溫度下短期穩(wěn)定性結(jié)果

圖6 5.00%、2.50%質(zhì)控品-20℃長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果

圖7 5.00%質(zhì)控品不同測(cè)序深度與靈敏度的關(guān)系

圖8 2.50%質(zhì)控品不同測(cè)序深度與靈敏度的關(guān)系

圖9 5.00%質(zhì)控品Levey-Jennings質(zhì)控圖

圖10 2.50%質(zhì)控品Levey-Jennings質(zhì)控圖

2.5 特異性試驗(yàn)

同時(shí)采用人多基因突變檢測(cè)通用試劑盒(燃石醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，295 Panel)分別對(duì)5.00%、2.50%的突變質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，只有7個(gè)突變位點(diǎn)，并無(wú)其他交叉陽(yáng)性，特異性符合要求。

3 討 論

目前我國(guó)和世界上各實(shí)驗(yàn)室所使用的高通量檢測(cè)均為實(shí)驗(yàn)室自建試驗(yàn)。這意味著高通量檢測(cè)在臨床應(yīng)用中具有非常大的靈活性，也意味著高通量檢測(cè)臨床應(yīng)用具有較大的風(fēng)險(xiǎn)性，這給高通量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的管理、人員培訓(xùn)和質(zhì)量控制等(包括檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和生物學(xué)信息分析)帶來(lái)巨大的壓力[21-23]。二代測(cè)序檢測(cè)項(xiàng)目與傳統(tǒng)檢測(cè)項(xiàng)目相比具有質(zhì)控點(diǎn)多、自配試劑多、指南標(biāo)準(zhǔn)少及檢驗(yàn)過(guò)程的性能驗(yàn)證和確認(rèn)還不完備[24-25]等特點(diǎn)。因此，高通量實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制(internal quality control，IQC) 是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的重要環(huán)節(jié)，已成為各級(jí)實(shí)驗(yàn)室日常工作中一項(xiàng)不可或缺的內(nèi)容。本研究嚴(yán)格按照高通量測(cè)序技術(shù)的質(zhì)量控制要求及方法，并且自制外部質(zhì)控品進(jìn)行IQC，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性。分析前對(duì)樣本的運(yùn)輸和保存進(jìn)行質(zhì)量控制，分析中需要病理醫(yī)師對(duì)可評(píng)估的樣本進(jìn)一步明確病理診斷，并評(píng)價(jià)標(biāo)本有無(wú)出血、壞死和不利于核酸檢測(cè)的前處理(例如含鹽酸脫鈣液處理)，病變細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)的總量和比例，避免假陰性：組織標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞含量建議達(dá)到20%以上，低于此標(biāo)準(zhǔn)可富集后檢測(cè)[26-29]；再如，在進(jìn)入高通量檢測(cè)流程環(huán)節(jié)，核酸質(zhì)量是高通量檢測(cè)成功的關(guān)鍵因素[30]，在制備文庫(kù)前應(yīng)采用多種方法對(duì)核酸質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，包括純度、濃度和完整性分析[31-33]；在文庫(kù)制備過(guò)程中，需要對(duì)文庫(kù)的濃度，片段大小等進(jìn)行質(zhì)量分析，每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)設(shè)定其文庫(kù)質(zhì)量的要求，明確接受或拒絕的標(biāo)準(zhǔn)；分析后需要對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步質(zhì)量控制，看數(shù)據(jù)質(zhì)量是否滿足生信分析需求等等。

基因組DNA能夠涵蓋包括野生型、純合突變型和雜合突變型在內(nèi)的所有突變類型。因此本研究利用日常檢驗(yàn)陽(yáng)性及陰性樣本自制質(zhì)控品，將檢測(cè)樣本作為質(zhì)控品可以模擬基因組復(fù)雜性，與檢測(cè)標(biāo)本具有相同性質(zhì)，既符合臨床檢測(cè)的需要又節(jié)省了成本，同時(shí)該質(zhì)控物穩(wěn)定性和特異性較強(qiáng)。此核酸質(zhì)控品從日常檢測(cè)的樣本中獲取，一般選擇核酸溶液超過(guò)100 μL且濃度高于100 ng /μL 的樣本核酸，根據(jù)200 ng的投入量需求，每次實(shí)驗(yàn)僅需要1～2 μL質(zhì)控核酸，此質(zhì)控品可以保證一個(gè)實(shí)驗(yàn)室6個(gè)月以上的IQC需要。本實(shí)驗(yàn)選擇的自制質(zhì)控品從來(lái)源上難以大量獲得，且未經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)物篩選檢測(cè)，但樣本混合后檢測(cè)的實(shí)際突變頻率與預(yù)期突變頻率基本一致，但是也有個(gè)別差異稍大，原因可能有如下幾點(diǎn)：樣本間的差異性、探針捕獲效率的不同、在稀釋混合樣本中帶來(lái)的誤差等，這些都可能導(dǎo)致后面檢測(cè)結(jié)果突變頻率的偏差。雖然質(zhì)粒沒(méi)有來(lái)源限制，且突變頻率比較容易控制，但是質(zhì)粒不能檢測(cè)核酸提取過(guò)程，不能全面地監(jiān)控試劑盒的檢測(cè)能力。

綜上，本實(shí)驗(yàn)室自制質(zhì)控品達(dá)到了本研究所建立的高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)流程及內(nèi)部質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)體系的全部參考數(shù)值，突變頻率在2.50%～5.00%也能被穩(wěn)定檢測(cè)出，未出現(xiàn)假陰性，說(shuō)明質(zhì)控品的建立可以使檢測(cè)結(jié)果可靠、準(zhǔn)確度高，顯示該標(biāo)準(zhǔn)體系的參數(shù)具有廣泛的參考意義，對(duì)測(cè)序結(jié)果正確性、穩(wěn)定性起到舉足輕重的作用，也為同行或即將開(kāi)展該門(mén)技術(shù)的相關(guān)醫(yī)技和科研人員提供參考或借鑒意義，同時(shí)促進(jìn)高通量測(cè)序技術(shù)更好地進(jìn)入臨床應(yīng)用和科研工作中，以助精準(zhǔn)醫(yī)療一臂之力。

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