白金玉，宋慧敏，徐苗，徐嘉琪，韓彬，彭曉莉

610500 成都，成都醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院

近二十年來，全球乳腺癌的發(fā)病率不斷上升，成為很多地區(qū)女性最常見的惡性腫瘤，威脅女性的身心健康[1]。植物化學(xué)物抗癌研究成為乳腺癌防治研究的方向之一[2]?；ㄇ嗨貙冱S酮類化合物，在植物中花青素以花色苷的形式存在，具有抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性，對(duì)多種疾病具有防治作用，如腫瘤、心血管疾病等[3]。飛燕草素是花青素中常見的一種單體，生物學(xué)活性較強(qiáng)，研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有抗乳腺癌的作用[4-6]。乳腺癌是激素依賴性腫瘤，雌激素受體表達(dá)是乳腺癌內(nèi)分泌治療的一項(xiàng)重要指標(biāo)。雌激素通過與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮生理效應(yīng)。雌激素受體包括核受體和膜受體。雌激素受體-α(estrogen receptor-α，ER-α)屬核受體，位于細(xì)胞核中，與其配體結(jié)合后通過調(diào)節(jié)下游靶基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用。乳腺癌內(nèi)分泌治療的雌激素替代療法就是以ER-α作為治療指標(biāo)[7]。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G protein coupled estrogen receptor，GPER)屬膜受體，與配體結(jié)合后能快速調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在乳腺癌的發(fā)生中也發(fā)揮著重要作用[8]。

本課題組前期通過建立甲基亞硝基脲(1-methyl-1-nitrosourea，MNU)誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌發(fā)生模型，發(fā)現(xiàn)飛燕草素能顯著抑制大鼠乳腺癌發(fā)生[9]。為進(jìn)一步探討飛燕草素抑制乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)取飛燕草素膳食干預(yù)致癌物誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生的大鼠模型乳腺組織，檢測大鼠乳腺組織中ER-α的表達(dá)水平，并通過乳腺癌MCF-7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探索飛燕草素是否通過調(diào)節(jié)ER-α和GPER的表達(dá)而抑制乳腺癌的發(fā)生。另外，ER-α對(duì)Notch信號(hào)通路有調(diào)節(jié)作用[10]，而Notch信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用，并且通過誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲，是促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要通路之一[11]。因此，本研究亦嘗試探討飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞Notch信號(hào)通路的影響，為飛燕草素抗乳腺癌的機(jī)制探索提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

飛燕草素(純度25%)購于中國大興安嶺林格貝寒帶生物科技股份有限公司。ER-α和GPER抗體購自美國Abcam公司。MNU和雌二醇購于美國Sigma公司。

1.2 儀器

主要使用儀器包括日本Olympus公司的IX71型倒置熒光相差顯微鏡；美國Thermo公司的Biofuge stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和ND-2000微量紫外可見光分光光度計(jì)；Bio-Rad伯樂公司PCR儀，石蠟切片儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí) Sprague-Dawley(SD)大鼠：40～50 d，體重140～160 g，大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)飲食，環(huán)境濕度保持40%～50%，環(huán)境溫度保持(22±2)℃。

1.4 飛燕草素干預(yù)大鼠乳腺癌發(fā)生模型的建立

動(dòng)物分組及處理方式：雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組12只；對(duì)照組16只；飛燕草素干預(yù)組16只。大鼠分組后，適應(yīng)飼養(yǎng)7 d，對(duì)照組和飛燕草素干預(yù)組給予MNU注射，正常對(duì)照組給予等體積生理鹽水注射。MNU臨用前，使用含0.05%冰醋酸的無菌生理鹽水配制成10 mg/mL的溶液，以50 mg/kg體重的劑量，對(duì)大鼠進(jìn)行單次腹腔注射。實(shí)驗(yàn)過程中，飛燕草素干預(yù)組以灌胃方式給予飛燕草素，灌胃劑量為100mg/kg/d，；對(duì)照組和正常對(duì)照組組給予等體積生理鹽水灌胃。大鼠每周稱重1次，自由飲食和飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取大鼠乳腺組織石蠟切片。

1.5 免疫組化染色

乳腺組織石蠟包埋，切片后進(jìn)行免疫組化染色，辣根過氧化物酶顯色試劑盒進(jìn)行顯色處理，用PBS緩沖液作為陰性對(duì)照，雌激素受體抗體免疫組化染色后以細(xì)胞核呈中等強(qiáng)度棕黃色判定為陽性細(xì)胞，在低倍鏡下(×10)瀏覽整張切片選擇熱點(diǎn)區(qū)域，用高倍(×40)對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果表示為陽性細(xì)胞在整張切片中同類型細(xì)胞中的百分比。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，使用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)方法進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)開始前4 d將細(xì)胞用PBS洗滌后，改用無酚紅DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

MCF-7細(xì)胞細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，以5×104個(gè)/mL細(xì)胞的密度接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞貼壁生長至80%左右，以0、10、20、40 μM飛燕草素作用細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，120 000×g離心，取上清液，測定蛋白含量后用于分析。探討雌二醇存在時(shí)，飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER蛋白表達(dá)的影響，加入1×10-8mol/L雌二醇12 h以后，再加入40 μM飛燕草素作用MCF-7細(xì)胞24 h后提取蛋白。

1.7 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

對(duì)數(shù)期的MCF-7細(xì)胞以1×105/mL密度接種于12孔培養(yǎng)板。細(xì)胞生長至75%密度，分別以0、20、40 μM飛燕草素作用細(xì)胞，24 h后用20 μL槍頭沿線垂直劃痕，PBS沖洗除去懸浮細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，在劃痕0、24 h和48 h拍照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取5個(gè)視野。計(jì)算遷移率，計(jì)算公式為：遷移率(%)=劃痕后某時(shí)間點(diǎn)測得的無細(xì)胞區(qū)域面積/劃痕后測得的劃痕面積×100%。

1.8 Western blot檢測乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α、GPER、Notch-1和 PTEN蛋白表達(dá)

調(diào)節(jié)蛋白樣品濃度，保證每個(gè)樣品上樣量為35 μg。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，BSA封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)，ER-α和GPER抗體4℃孵育過夜；二抗孵育后，化學(xué)試劑顯色發(fā)光，采用多功能成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。

1.9 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR)檢測ER-α和GPER mRNA水平

飛燕草素作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR方法檢測ER-α和GPER mRNA水平。采用ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量。調(diào)節(jié)樣品cDNA濃度后，加入4 μg cDNA、12.5 μL SYBR混合物和1 μL引物組成25μL反應(yīng)體系。首先在95℃下變性10 min，并進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(95℃15 s，60℃ 1 min)。按體系進(jìn)行反應(yīng)，各基因分別設(shè)3孔平行。采用結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，將GAPDH作為內(nèi)參照的基因。所用的引物見表1。

表1 qPCR引物序列

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié) 果

2.1 飛燕草素對(duì)乳腺癌組織雌激素受體表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法檢測大鼠乳腺組織ER-α表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組、對(duì)照組和飛燕草素干預(yù)組大鼠乳腺組織ER-α均有陽性表達(dá)。與正常對(duì)照組比較，MNU致癌組大鼠乳腺組織ER-α表達(dá)顯著增高(P<0.01)，飛燕草素干預(yù)大鼠能明顯降低大鼠乳腺組織ER-α的表達(dá)(P<0.01)。

圖1 飛燕草素對(duì)致癌物誘導(dǎo)大鼠乳腺組織ER-α表達(dá)的影響 (×400)

2.2 飛燕草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移能力的影響

劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h時(shí)，40 μM飛燕草素作用后細(xì)胞劃痕面積明顯高于0 μM和20μM飛燕草素作用后的細(xì)胞(P<0.01，P<0.05)；48 h時(shí)，40 μM飛燕草素作用后細(xì)胞劃痕面積明顯高于0 μM和20 μM飛燕草素作用后的細(xì)胞(P<0.01)。結(jié)果表明40 μM飛燕草素作用細(xì)胞后，能顯著抑制MCF-7細(xì)胞的遷移能力(圖2)，提示飛燕草素對(duì)MCF-7細(xì)胞的遷移能力具有抑制作用。

圖2 飛燕草素對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移的影響

2.3 飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)CCK-8預(yù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)采用0、10、20、40 μM飛燕草素作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞，通過Western blot檢測飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER蛋白表達(dá)的影響。由圖3可見，飛燕草素能明顯降低MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER蛋白表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果也顯示，飛燕草素能顯著降低MCF-7細(xì)胞中ER-α和GPER mRNA水平(P<0.01)(圖4，圖5)。

圖3 飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER蛋白表達(dá)的影響

2.4 雌二醇存在條件下飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探討飛燕草素對(duì)ER-α和EPER蛋白表達(dá)是否與雌激素有關(guān)。實(shí)驗(yàn)在飛燕草素作用MCF-7細(xì)胞以前，在培養(yǎng)液中加入1×10-8mol/L雌二醇，再檢測ER-α和EPER蛋白表達(dá)。由圖6可見，雌二醇作用后的MCF-7細(xì)胞，40 μM飛燕草素仍能降低ER-α和EPER蛋白表達(dá)水平，提示飛燕草素在雌二醇環(huán)境下仍能抑制ER-α和EPER蛋白表達(dá)。

圖4 飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α mRNA水平的影響

圖5 飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞GPER mRNA水平的影響

圖6 雌二醇環(huán)境下飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和EPER蛋白表達(dá)的影響

2.5 飛燕草素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞Notch-1/PTEN信號(hào)通路的影響

飛燕草素作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞24 h后檢測飛燕草素對(duì)Notch通路的Notch-1和PTEN蛋白表達(dá)的影響。由WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖7)可見，20 μM和40 μM飛燕草素作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞能顯著降低細(xì)胞Notch-1蛋白表達(dá)，提高PTEN蛋白表達(dá)水平。

3 討 論

雌激素在體內(nèi)與雌激素受體結(jié)合，發(fā)生雌激素受體二聚化后，與靶基因的雌激素反應(yīng)元件結(jié)合，繼而激活Notch、MAPK、PI3K和JNK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生[12]。人工合成的純雌激素拮抗劑氟維司群就是利用其可與ER-α結(jié)合的能力，阻斷雌激素受體的信號(hào)途徑，而成為抗乳腺癌的藥物[13]。GPER是一種新型雌激素受體，能夠在多種乳腺癌細(xì)胞中介導(dǎo)雌激素效應(yīng)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，研究GPER與乳腺癌內(nèi)分泌治療有關(guān)[14]。有研究報(bào)道海南蒲桃(SyzygiumcuminiL，即印度稱為jamun的漿果)富含花色苷，能抑制雌激素誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌發(fā)生，并能降低ER-α蛋白表達(dá)水平[15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素能顯著抑制致癌物誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌發(fā)生[9]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)飛燕草素能抑制大鼠乳腺組織內(nèi)ER-α水平的升高，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)飛燕草素能明顯降低乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER的蛋白表達(dá)水平，提示飛燕草素作用于雌激素受體通路可能是其發(fā)揮抑制乳腺癌作用的機(jī)制之一。

研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而雌激素可通過Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)乳腺癌血管的生成，促進(jìn)乳腺癌生長，阻斷Notch信號(hào)通路的表達(dá)或可成為腫瘤治療的新方向[16]。研究證實(shí)抑制乳腺癌細(xì)胞中的Notch-1通路，能降低其下游蛋白的表達(dá)，從而有效地抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。抑癌基因PTEN可通過促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞遷移、抑制腫瘤血管生成等途徑，阻遏抑制乳腺癌發(fā)生發(fā)展[18]。研究發(fā)現(xiàn)激活Notch信號(hào)通路引起PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)是乳腺癌干細(xì)胞發(fā)生耐藥的重要分子機(jī)制，抑制Notch-1，促進(jìn)PTEN的表達(dá)，可以提高乳腺癌干細(xì)胞對(duì)藥物敏感性[19]。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飛燕草素能明顯降低乳腺癌MCF-7細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)，提高PTEN蛋白表達(dá)水平。結(jié)果提示飛燕草素可能通過雌激素受體，調(diào)節(jié)Notch-1/PTEN信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑制乳腺癌的作用。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)飛燕草素能抑制致癌物誘導(dǎo)大鼠乳腺癌組織ER-α的表達(dá)增高，對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ER-α和GPER的蛋白表達(dá)具有抑制作用，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)飛燕草素能調(diào)節(jié)乳腺癌MCF-7細(xì)胞Notch-1/PTEN信號(hào)通路。飛燕草素是否通過ER-α調(diào)節(jié)Notch-1/PTEN信號(hào)通路，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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