余水生，陳智強，王衛(wèi)東，張英川，張乃芳，喬 芬

（1.遂昌縣林業(yè)發(fā)展中心,浙江遂昌323300;2.麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院,浙江麗水323000）

物種名錄是進行生物多樣性研究、保護、利用以及管理的重要基礎(chǔ)資料[1]。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，越來越多的兩棲動物新種和新記錄被描述[1]，一些珍稀兩棲動物隱存種被證實[2]。僅在2015—2019年間，中國新增兩棲動物新記錄18種，新描述或恢復(fù)有效種74種[1]。同時，基于分子技術(shù)證實湍蛙屬的物種多樣性遠被低估[3-4]。因此，依據(jù)分子技術(shù)確定物種的有效性是可行且具有重要意義的。

張氏樹蛙屬（Zhangixalus）隸屬于無尾目樹蛙科，現(xiàn)共記錄28種[5]，主要分布于我國在內(nèi)的東亞地區(qū)[1]，是我國東南部動物類群的重要組成部分。其中，麗水樹蛙（Z.lishuiensis）、安徽樹蛙（Z.zhoukaiyae）、突肛樹蛙（Z.pachyproctus）等3種張氏樹蛙屬新物種在2017—2019年間被描述[6-8]。2019年，Jiang等在線粒體分子系統(tǒng)學(xué)研究基礎(chǔ)上，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生物地理分布情況，將原廣義樹蛙屬（Rhacophorus sensu lato）拆分為3屬，即狹義樹蛙屬（Rhacophorus）、瘦樹蛙屬（Leptomantis）以及新命名的張氏樹蛙屬[9]。本研究基于全球28種張氏樹蛙屬物種的12S rRNA-tRNAval-16S rRNA序列，以2種樹蛙科樹蛙屬物種（雙斑樹蛙Rhacophorus bipunctatus和黑蹼樹蛙R.kio）作為外群，分析張氏樹蛙屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以期確定其物種有效性。

1 研究方法

1.1 序列獲取

28種張氏樹蛙屬（Zhangixalus）及2種樹蛙屬（Rhacophorus）線粒體部分基因序列均載自GenBank（表1）。

表1 本研究所用分子樣品和序列信息

表1 續(xù)表

1.2 序列比對與歧異指數(shù)

獲得的張氏樹蛙屬28種物種的12S rRNA-tRNAval-16S rRNA部分片段序列，長度為1 784～1 838 bp。序列堿基組成見表2。

表2 張氏樹蛙屬28種物種12SrRNA-tRNAval-16SrRNA序列的堿基組成

表2 續(xù)表

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的重建

用MEGA對所下載的30條12S rRNA-tRNAval-16S rRNA的部分序列進行對齊排列并截取長度一致的序列片段，隨后用pairwise uncorrected p-distance模型計算各樣本間的遺傳距離。

系統(tǒng)發(fā)育進化樹用貝葉斯法（Bayesian Inference,BI）在MrBayes 3.2.2上進行構(gòu)建。構(gòu)樹前，利用Mr-Modeltest 2.3選擇最適堿基替代模型為GTR+I+G，外群設(shè)置為樹蛙屬的雙斑樹蛙（R.bipunctatus）和黑蹼樹蛙（R.kio）。按照上述選擇的模型設(shè)置參數(shù)（Lset Nst=6，Rates=invgamma），隨機選取起始樹，隱馬氏鏈計算 4次（nchains=4），計算 106代（ngen=1 000 000），每 1 000代保存一棵樹（samplefreq=1 000），舍棄前1 000棵樹（burn in=1 000），利用剩余的樹生成一致樹。系統(tǒng)樹中結(jié)點的置信度由后驗概率（posterior probabilities）提供。

2 研究結(jié)果

2.1 遺傳距離

遺傳距離分析結(jié)果顯示：安徽樹蛙與麗水樹蛙之間的遺傳距離為1.1%；峨眉樹蛙（Z.omeimontis）與藍面樹蛙（Z.duboisi）之間的遺傳距離也為1.1%；其他張氏樹蛙屬物種間的遺傳距離均大于2.8%（表3）。

29 0.089 28 0.100 0.066 27 0.071 0.095 0.062 26 0.068 0.066 0.095 0.061 25 0.097 0.090 0.097 0.108 0.088 24 0.092 0.059 0.070 0.070 0.098 0.068 23 0.058 0.089 0.059 0.060 0.048 0.092 0.060 22 0.087 0.099 0.109 0.093 0.088 0.097 0.033 0.087 217 0.103 0.097 0.095 0.087 0.096 0.095 0.102 0.11 0.094 2096 0.093 0.060 0.069 0.086 0.064 0.073 0.065 0.093 0.065 0.0離距傳遺的列19 18 17 0.093 0.090 0.056 0.061 0.093 0.025 0.095 0.112 0.095 0.088 0.063 0.091 0.051 0.090 0.054 0.058 0.095 0.064 0.094 0.106 0.087 0.051 0.094 0.060 0.055 0.088 0.066 0.055 0.098 0.061 0.092 0.066 0.092 0.044 0.089 0.065序A N rR S val-16 A N tR -A N rR 12S蛙樹種30 3 16 15 14 31 12 11 10 9 8 0.043 0.119 0.125 0.121 0.075 0.080 0.081 0.129 0.050 0.059 0.034 0.078 0.120 0.048 0.055 0.041 0.032 0.084 0.128 0.053 0.059 0.058 0.057 0.060 0.073 0.123 0.041 0.028 0.063 0.035 0.037 0.034 0.088 0.129 0.053 0.059 0.064 0.066 0.061 0.049 0.061 0.074 0.124 0.054 0.067 0.102 0.090 0.097 0.090 0.098 0.091 0.135 0.092 0.088 0.056 0.043 0.054 0.049 0.053 0.074 0.119 0.011 0.045 0.066 0.064 0.062 0.052 0.066 0.080 0.125 0.059 0.069 0.100 0.094 0.101 0.098 0.100 0.081 0.133 0.093 0.099 0.093 0.086 0.091 0.090 0.097 0.090 0.137 0.088 0.087 0.047 0.057 0.044 0.037 0.043 0.073 0.120 0.049 0.059 0.070 0.068 0.066 0.065 0.064 0.078 0.130 0.056 0.071 0.101 0.090 0.093 0.091 0.096 0.083 0.135 0.091 0.095 0.067 0.059 0.064 0.059 0.064 0.077 0.118 0.050 0.059 0.070 0.062 0.065 0.065 0.066 0.075 0.126 0.059 0.065 0.037 0.064 0.022 0.041 0.036 0.087 0.127 0.054 0.065 0.098 0.089 0.096 0.092 0.101 0.097 0.130 0.088 0.090 0.064 0.011 0.060 0.058 0.064 0.076 0.122 0.042 0.031表70.086 0.082 0.130 0.081 0.090 0.084 0.085 0.082 0.084 0.089 0.106 0.083 0.090 0.104 0.104 0.085 0.094 0.096 0.091 0.086 0.089 0.108 0.083 6 0.114 0.098 0.098 0.141 0.098 0.105 0.097 0.103 0.097 0.108 0.100 0.074 0.097 0.101 0.113 0.079 0.091 0.103 0.118 0.098 0.098 0.104 0.085 0.098 5 0.089 0.081 0.043 0.031 0.118 0.072 0.050 0.046 0.054 0.039 0.050 0.056 0.088 0.031 0.059 0.091 0.084 0.050 0.059 0.089 0.056 0.058 0.054 0.085 0.042 4 0.043 0.093 0.084 0.053 0.044 0.123 0.068 0.054 0.049 0.058 0.049 0.058 0.052 0.088 0.048 0.054 0.088 0.084 0.047 0.061 0.086 0.053 0.059 0.059 0.086 0.053 3 0.118 0.116 0.132 0.120 0.121 0.119 0.073 0.119 0.121 0.115 0.122 0.122 0.121 0.116 0.135 0.118 0.113 0.136 0.133 0.112 0.124 0.128 0.119 0.123 0.122 0.129 0.124 2.143 0.142 0 0.142 0.165 0.146 0.150 0.146 0.158.141 0.145 0.148 0.144 0.150 0.145 0.144 0.159 0.145 0.144 0.159 0.160 0.147 0.151 0.150 0.146 0.142 0.146 0.163 0.148 0 1 219445）JX（蛙樹斑1.雙0.086 781700）B A （蛙樹蹼2.黑0.142 F066239）M （蛙樹納赫塔坎3.阿0.138 386560）C L （蛙樹笠4.衣0.136 215537）U E （蛙樹甸5.緬0.165 219432）JX（蛙樹甫6.經(jīng)0.143 215545）U E （蛙樹7.大0.145 219423）JX（蛙樹背8.綠0.139 219414）JX（蛙樹面9.藍0.154 219434）JX（蛙樹利10.杜0.136 4）21554 U E （蛙樹褶11.棕0.145 688883）JN（蛙樹溪12.巫0.138 0）21554 U E （蛙樹氏13.胡0.141 688879）JN（蛙樹佛14.洪0.142 653720）Y K （蛙樹水15.麗0.142 569）386 C L （蛙樹16.侏0.139 386570）C L （蛙樹灣17.臺0.155 219429）JX（蛙樹掌18.黑0.141 5）21553 U E （蛙樹眉19.峨0.142 386572）LC（蛙樹頓斯20.奧0.151 613222）N M （蛙樹翠21.翡0.157 170683）U K （蛙樹龍22.平0.140 688884）JN（蛙樹洱23.普0.145 369670）C L （蛙樹氏24.舒0.148 613214）N M （蛙樹大頜25.白0.141 386574）C L （蛙樹北26.臺0.145 386576）C L （蛙樹綠27.翠0.141 688880）JN（蛙樹川28.利0.157 322122）G M （蛙樹山29.瑤0.144 601499）U K （蛙樹徽30.安

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

系統(tǒng)進化樹分析表明，張氏樹蛙屬系統(tǒng)進化樹具有兩大分支：（1）阿坎塔赫納樹蛙（Z.achantharrhena）和杜利樹蛙（Z.dulitensis）聚為根部支系；（2）其他26種張氏樹蛙屬物種聚為一支（圖1）。

圖1 基于線粒體部分序列構(gòu)建的貝葉斯樹

3 討論

在本研究根據(jù)12SrRNA-tRNAval-16SrRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，阿坎塔赫納樹蛙和杜利樹蛙聚為根部支系，其他26種張氏樹蛙屬物種聚為一支。這個結(jié)論與Jiang等人[9]的研究結(jié)果相似，說明線粒體基因序列具有較強保守性的特點。

序列的差異性導(dǎo)致界定種水平的標(biāo)準也有所不同[10]。Kon等[11]和Camargo等[12]認為在以16S rRNA作為分子標(biāo)記時，當(dāng)種群遺傳距離超過2%，即認定達到了種的水平；陳智強等[10]將遺傳距離為1.4%的兩個樣本認定為北侖姬蛙（Microhyla beilunensis）的兩個不同地理種群。金義文等[13]將12S和16S rRNA的遺傳距離為1.1%的兩個不同地區(qū)的湍蛙樣本判定為同一物種的兩個不同種群。本研究結(jié)果顯示，安徽樹蛙與麗水樹蛙、峨眉樹蛙與藍面樹蛙之間的遺傳距離僅為1.1%，低于使用16S rRNA作為分子標(biāo)志的種間識別的最低差異程度。從系統(tǒng)發(fā)育樹上看，安徽樹蛙與麗水樹蛙、峨眉樹蛙與藍面樹蛙相互聚合。同時，關(guān)于藍面樹蛙的分類存在諸多爭議。該物種在2000年被命名[14]。在2001年被發(fā)現(xiàn)并被命名的屏邊泛樹蛙（Polypedates pingbianensis）[15]以及2008年被描述成新種的棘皮泛樹蛙（P.spinus）[16]均被認為是藍面樹蛙的同物異名?！吨袊鴦游镏荆簝蓷V》中，屏邊泛樹蛙則被認為是峨眉樹蛙的同物異名[17]。綜上所述，我們推測安徽樹蛙與麗水樹蛙、峨眉樹蛙與藍面樹蛙均為同物異名或亞種。

本研究使用的序列為12S rRNA-tRNAval-16S rRNA，未采用其他基因（如COΙ）進行進一步的序列對比，故將安徽樹蛙與麗水樹蛙、峨眉樹蛙與藍面樹蛙認定為同物異名或亞種的合理性有待后續(xù)新的分子標(biāo)記技術(shù)、生活史特征等方面的比較研究。