李巧云

（麗水市職業(yè)高級(jí)中學(xué)，浙江麗水323000）

白色念珠菌是一種常見條件致病性真菌[1]，可寄居在人體不同部位，如皮膚、口腔、胃腸道等，引起皮膚、黏膜病變，也可引起危及生命的系統(tǒng)性感染。隨著臨床上淺部和深部真菌感染發(fā)病率不斷增長(zhǎng)，念珠菌感染發(fā)病率在逐年升高，白色念珠菌已經(jīng)變成了重要的感染病原體之一。因此，尋找安全、有效的抗真菌藥物一直是研究的熱點(diǎn)。中草藥在抗白色念珠菌感染的預(yù)防和治療中具有一定的優(yōu)勢(shì)。

食涼茶屬于畬族民間草藥，為蠟梅科（Calycanthaceae）蠟梅屬（Chimonanthus）植物，學(xué)名柳葉蠟梅（Chimonanthus salicifolius）[2]。食涼茶性涼，味微苦、辛?，F(xiàn)代研究及臨床試驗(yàn)表明：食涼茶有明顯的解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒等作用，其中在抗菌方面，食涼茶揮發(fā)油被驗(yàn)證具有良好的生物活性。李萍[3]等人通過體內(nèi)外抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山臘梅感冒茶對(duì)金黃色葡萄球菌感染有明顯的抑制作用；刁君成[4]等人對(duì)山臘梅葉消毒抑菌作用開展了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)山臘梅葉藥片溫?zé)嵴舭l(fā)物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用。但目前對(duì)其抗菌作用的研究主要集中在細(xì)菌感染方面，而抗真菌的報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以食涼茶揮發(fā)油為研究對(duì)象，開展食涼茶揮發(fā)油體外抗真菌試驗(yàn)，希望能為民族醫(yī)藥抗真菌研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

二氯甲烷、無(wú)水硫酸鈉、吐溫-80、RPMI1640液體培養(yǎng)基、刃天青（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌種和材料

白色念珠菌（中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心）、食涼茶（購(gòu)自藥材市場(chǎng)）。

1.3 儀器

XL-06B300克密封型搖擺式粉碎機(jī)（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）；TC-15恒溫電熱套（海寧市華星儀器廠）；揮發(fā)油測(cè)定器、超凈工作臺(tái)（博迅SW-CJ-1CU）等。

1.4 食涼茶揮發(fā)油提取方法

經(jīng)粉碎后的食涼茶粉末，過20目標(biāo)準(zhǔn)篩。準(zhǔn)確稱取過篩后的藥材粉末30 g置于圓底燒瓶中，加入玻璃珠數(shù)粒，按料液比加入蒸餾水，玻璃棒攪拌均勻。浸泡一段時(shí)間后，按2015版《中國(guó)藥典》（通則2204）揮發(fā)油測(cè)定法甲法提取，停止加熱，分取油層，用二氯甲烷萃取，再經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥[5]，常溫?fù)]去二氯甲烷后采用減重法稱定揮發(fā)油的重量，并計(jì)算揮發(fā)油提取率。

揮發(fā)油提取率（%）=提取的揮發(fā)油的重量（g）/藥材粉末質(zhì)量（g）×100%

1.5 菌液及藥物的制備

將保存的白色念珠菌劃線分離純化后，挑取單菌落于沙氏液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24 h，獲得白色念珠菌菌液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法[6]在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，用0.9%無(wú)菌生理鹽水調(diào)整使初始菌懸液濃度控制在1.5×106CFU/mL。取適量初始菌懸液用RPMI1640液體培養(yǎng)基稀釋1 000倍，使菌懸液的最終濃度控制在1×103～5×103CFU/mL，即得接種菌懸液。將揮發(fā)油以吐溫-80溶解[7]后，用RPMI1640液體培養(yǎng)基倍比稀釋，制取終質(zhì)量濃度為500 mg/mL及1 mg/mL的揮發(fā)油藥液，吐溫-80終體積分?jǐn)?shù)為0.005%（V/V）。

1.6 刃天青法檢測(cè)揮發(fā)油對(duì)白色念珠菌最低抑菌濃度（MIC）

用96孔板微量稀釋法[8-9]，制成含揮發(fā)油50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25、0.390 625、0.195 312 5和0.097 656 mg/mL的系列濃度藥物，向1～11孔中各加100 μL接種菌懸液。第11孔為生長(zhǎng)對(duì)照，第12孔為空白培養(yǎng)基對(duì)照，處理三組重復(fù)。96孔板用封口膜密封置于濕盒中，35℃培養(yǎng)12 h后向每孔中加入過濾除菌后的1 g/dL刃天青試劑2 μL，觀察其顏色變化。以第11孔陽(yáng)性對(duì)照由藍(lán)色（氧化狀態(tài)）變?yōu)榉奂t色（還原狀態(tài)）、第12孔空白對(duì)照保持藍(lán)色作為判斷實(shí)驗(yàn)操作是否合格的標(biāo)準(zhǔn)。以發(fā)生顏色變化的前一孔為最低抑菌濃度（MIC）[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 食涼茶揮發(fā)油提取工藝的研究

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 提取時(shí)間的選擇

設(shè)置提取時(shí)間為 0.5、1、1.5、2、2.5 h，料液比（mg/mL）為1:8，不浸泡，按1.4的方法進(jìn)行提取并計(jì)算其提取率，結(jié)果如圖1所示。提取開始時(shí)，食涼茶揮發(fā)油的提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)達(dá)到最高，隨后又慢慢降低。分析：可能由于隨著提取時(shí)間的增加，料液中的揮發(fā)油逐漸被提取完全，隨后由于繼續(xù)加熱，使揮發(fā)油揮發(fā)，導(dǎo)致提取率有所下降。綜上所述，因此選取1.5 h、2 h、2.5 h 進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.1.2 浸泡時(shí)間的選擇

設(shè)置料液比（mg/mL）為 1:8，提取 1.5 h，按 1.4的方法進(jìn)行提取并計(jì)算其提取率，結(jié)果如圖2所示。食涼茶揮發(fā)油提取率隨浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后降低，在浸泡時(shí)間2 h處達(dá)到最高，說(shuō)明浸泡時(shí)間對(duì)食涼茶揮發(fā)油的提取有影響。有研究[11-12]認(rèn)為，浸泡可使植物組織細(xì)胞充分膨脹，細(xì)胞間隙變大，從而加快細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的動(dòng)態(tài)交換促進(jìn)有效成分的溶出，但過度浸泡會(huì)使食涼茶組織受損，料液體系變得復(fù)雜，影響揮發(fā)油的提取，并可能導(dǎo)致?lián)]發(fā)油的散失。故細(xì)化最佳浸泡時(shí)間，選擇1.5 h、2.0 h、2.5 h進(jìn)行后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.1.3 料液比的選擇

設(shè)置料液比（mg/mL） 為 1:8、1:10、1:12、1:14、1:16，提取時(shí)間為 1.5 h，不浸泡，按 1.4的方法進(jìn)行提取并計(jì)算其提取率，結(jié)果如圖3所示。在1:8～1:10間隨著料液比的增加，食涼茶揮發(fā)油提取率上升趨勢(shì)顯著。而在1:10～1:14范圍內(nèi)，食涼茶揮發(fā)油提取率隨料液比的增大穩(wěn)定下降。雖然在1:16處有回升趨勢(shì)，但料液比過大，容易導(dǎo)致料液暴沸，同時(shí)能耗也隨之增加。因此從節(jié)約能源和提取效率角度考慮，實(shí)驗(yàn)選取1:9、1:10、1:11三個(gè)料液比梯度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖1 提取時(shí)間對(duì)食涼茶揮發(fā)油提取率的影響

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)食涼茶揮發(fā)油提取率的影響

圖3 料液比對(duì)食涼茶揮發(fā)油提取率的影響

2.1.2 正交試驗(yàn)

采用水蒸氣蒸餾法，以食涼茶揮發(fā)油提取率為考察指標(biāo)，以提取時(shí)間（A）、浸泡時(shí)間（B）、料液比（C）為影響因素[13]進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14]考察不同因素對(duì)揮發(fā)油提取率的影響。由表1極差分析可知，3個(gè)因素對(duì)食涼茶揮發(fā)油提取率的影響大小為B>C>A，即浸泡時(shí)間>料液比>提取時(shí)間。揮發(fā)油提取工藝的最佳組合為A2B3C2，即提取時(shí)間2.0 h，浸泡時(shí)間2.5 h，料液比1:10。

表1 食涼茶揮發(fā)油正交試驗(yàn)結(jié)果分析表

2.1.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳組合方案做3組平行試驗(yàn)，取其平均值，食涼茶揮發(fā)油提取率為1.95%。

2.2 食涼茶揮發(fā)油體外抗白色念珠菌效果

刃天青法檢測(cè)揮發(fā)油對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度（MIC），是以刃天青作為指示劑，通過觀察孔內(nèi)顏色，判斷食涼茶揮發(fā)油的抑菌活性。活菌新陳代謝的產(chǎn)生，使刃天青指示劑由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色，而死菌則不能。表2是加入刃天青后各孔顏色顯示情況，通過對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，食涼茶揮發(fā)油對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度（MIC）為6.25 mg/mL。將1～4孔的菌藥混合物涂布培養(yǎng)后顯示，第4孔有白色念珠菌單菌落長(zhǎng)出，而從1～3孔中取出的混合液沒有長(zhǎng)出白色念珠菌，故最低殺菌濃度（MBC）為12.5 mg/mL。

3 討論

食涼茶作為畬族常用藥材，歷史悠久，療效多樣，在藥用、保健等方面具有較好的開發(fā)利用價(jià)值。揮發(fā)油是食涼茶的主要成分之一，近年來(lái)，對(duì)該類物質(zhì)的研究也有很多，目前已知食涼茶在抗菌等方面具有良好的生物活性，但相關(guān)研究主要集中于抗細(xì)菌感染，未見抗真菌感染的研究報(bào)道，因此，筆者在此基礎(chǔ)上對(duì)其抗真菌作用展開相關(guān)研究，以完善食涼茶的抗菌作用。

揮發(fā)油作為食涼茶的主要成分之一，含有許多具有藥理活性的有效物質(zhì)，食涼茶揮發(fā)油質(zhì)量的穩(wěn)定，是其藥理活性的保證，因此對(duì)其揮發(fā)油提取工藝的研究具有重要價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取時(shí)間、料液比、浸泡時(shí)間對(duì)食涼茶揮發(fā)油的提取率均有影響，其中浸泡時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響最大，料液比其次，最后是提取時(shí)間，這可能與食涼茶日常飲用方式有關(guān)，浸泡時(shí)間及料液比對(duì)其揮發(fā)性物質(zhì)的溶出有較為密切的影響。

本實(shí)驗(yàn)采用刃天青法測(cè)得食涼茶揮發(fā)油對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度（MIC）為6.25 mg/mL，最小殺菌濃度為12.5 mg/mL。通過觀察各孔顏色發(fā)現(xiàn)，在加入刃天青后，最低抑菌濃度（即未變紅的孔）會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)向高濃度推移，這與李宙陽(yáng)[15]等人研究結(jié)果一致，但達(dá)到上述濃度后孔內(nèi)顏色能維持較長(zhǎng)時(shí)間不再變化，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，食涼茶揮發(fā)油的優(yōu)化提取條件為：提取時(shí)間2.0 h，浸泡時(shí)間2.5 h，料液比1:10，在此條件下食涼茶揮發(fā)油的提取率為1.95%。通過實(shí)驗(yàn)證明食涼茶揮發(fā)油對(duì)白色念珠菌體內(nèi)體外均有抑制效果，食涼茶揮發(fā)油對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度（MIC）為 6.25 mg/mL，最小殺菌濃度（MBC）為12.5 mg/mL。本研究為食涼茶揮發(fā)油藥物的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，并為更多真菌感染的治療提供參考。

表2 刃天青法測(cè)MIC中顏色與藥物濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系