張宇航 潘冉冉 李飛 陶志強(qiáng) 王英 高和瓊 莊南生

摘 ?要：生長(zhǎng)調(diào)控因子（growth-regulating factors，GRF）是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子家族成員數(shù)目較多，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。以巴西橡膠樹優(yōu)良品種‘熱研7-33-97為材料，通過RT-PCR方法進(jìn)行HbGRF基因的克隆;利用生物信息學(xué)的方法對(duì)其蛋白序列、理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析;利用IS-PCR技術(shù)和FISH技術(shù)對(duì)其進(jìn)行物理定位分析;采用qRT-PCR對(duì)橡膠樹中HbGRF基因的表達(dá)模式進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在橡膠樹雌花中克隆到3個(gè)GRF基因，分別命名為HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3，分子量分別為65.663、41.188、52.858 kDa，其編碼的蛋白長(zhǎng)度分別為609、384、494 aa，均為不穩(wěn)定蛋白;3個(gè)基因均具有GRF完整的特征結(jié)構(gòu)域WRC和QLQ，分別屬于3個(gè)不同亞族?；蛭锢矶ㄎ唤Y(jié)果表明，HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因分別位于橡膠樹染色體的第11號(hào)長(zhǎng)臂、第5號(hào)短臂和第9號(hào)長(zhǎng)臂上，基因到著絲粒的平均百分距離是77.65、42.66和65.27。表達(dá)結(jié)果顯示，橡膠樹3個(gè)HbGRF基因在莖尖、雌花等生長(zhǎng)旺盛的組織中表達(dá)量較高，用外源赤霉素和脫落酸處理后，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，經(jīng)過48 h后表達(dá)量和初始值基本持平，3個(gè)基因在莖尖、雌花中有明顯的表達(dá)特異性，可能在橡膠樹花芽分化及雌花的發(fā)育過程中起到了重要作用。該結(jié)果為研究橡膠樹HbGRF基因的功能及作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，為橡膠樹精準(zhǔn)育種提供了分子細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹;GRF基因家族;基因定位;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S794.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Growth-regulating factor （GRF） is a plant-specific transcription factor. The transcription factor family has a large number of members and plays an important role in plant growth and development. In this study， the excellent clone ‘Reyan 7-33-97 was used as the experimental material， and the HbGRF genes were cloned by RT-PCR. The bioinformatics method was used to study its gene length， physicochemical properties， basic structure and evolutionary relationship. The physical localization analysis was carried out by in situ PCR and fluorescence in situ hybridization. The expression pattern of HbGRF genes in rubber trees was analyzed by qRT-PCR. Three GRF genes were cloned into the female flowers of rubber trees， named HbGRF1， HbGRF2 and HbGRF3， respectively. The protein length was 609 aa， 384 aa and 494 aa with molecular weight of 65.663 kDa， 41.188 kDa and 52.858 kDa， respectively， and they were all unstable protein. All the three members had the complete characteristic domains WRC and QLQ of GRF gene family. Evolutionary analysis showed that the three genes belonged to three different groups. HbGRF1， HbGRF2 and HbGRF3 were located on the long arm of chromosome 11， the short arm of chromosome 5 and the long arm of chromosome 9， and the average percentage distance between the signal site and the centromere was 77.65， 42.66 and 65.27， respectively. The expression results showed that the three HbGRF genes in rubber trees were highly expressed in the vigorous growth tissues like stem tips and female flowers. Under the treatment of exogenous GA and ABA， the expression levels of the three genes increased first， and the expression levels at 48 h were basically the same as those under the initial conditions. The three genes had obvious expression specificity in stem tips and female flowers， which may play important roles in flower bud differentiation and female flower development. This study would provide a theoretical basis and materials for further exploration of the function of HbGRF， and provide molecular cytology basis for accurate breeding of rubber trees.

Keywords： Hevea brasiliensis; GRF gene family; gene mapping; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.001

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）屬于大戟科橡膠樹屬[1]，其產(chǎn)生的膠乳在工業(yè)、國(guó)防等領(lǐng)域有著十分重要的作用。橡膠樹喜高溫、高濕的生長(zhǎng)環(huán)境，易受極端天氣的影響，微弱的生長(zhǎng)環(huán)境變化就會(huì)導(dǎo)致膠乳品質(zhì)和產(chǎn)量的下降[2]。生長(zhǎng)調(diào)控因子（growth-regulating factors， GRF）是一類成員數(shù)目較多的、植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育等過程的調(diào)控[3-5]。本研究通過克隆橡膠樹HbGRF基因，并進(jìn)行了基因定位及表達(dá)分析，為研究橡膠樹HbGRF基因的功能及作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，也為橡膠樹精準(zhǔn)育種提供了理論指導(dǎo)。植物里最先被發(fā)現(xiàn)的GRF基因是水稻的OsGRF1，它編碼的蛋白通過調(diào)控赤霉素影響莖的伸長(zhǎng)[6]。目前，已報(bào)道的GRF家族基因在擬南芥和水稻中分別有9個(gè)和12個(gè)成員[7-8]，楊樹中有19個(gè)成員[9]，番茄中有13個(gè)成員[10]，陸地棉中有33個(gè)成員[11]，油菜中有34個(gè)成員[12]，煙草中有25個(gè)成員[13]，桃樹中有10個(gè)成員[14]，茶樹中有11個(gè)成員[15]，藜麥中有18個(gè)成員[16]。該基因家族編碼的蛋白序列的N末端一般含有QLQ（Gln、Leu、Gln）和WRC（Trp、Arg、Cys）2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，QLQ結(jié)構(gòu)域與GRF互作因子（GRF-interacting factor， GIF）相互作用形成轉(zhuǎn)錄激活因子[17]，WRC中包含一個(gè)與DNA相結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)和核定位信號(hào)區(qū)域（NLS），它們?cè)诨蛐惺蛊渖飳W(xué)功能方面起到了重要作用[7]。在植物中，GRF基因家族的成員在發(fā)育活躍的部位如花芽、根尖及幼葉中表達(dá)量較高，在成熟的部位表達(dá)量相對(duì)較低[18-19]，多種GRF基因在葉和莖的生長(zhǎng)、花的發(fā)育、胚珠形成等方面發(fā)揮了重要的作用，GRF基因還可通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制在植物滲透脅迫下發(fā)揮作用[7]。目前，在楊樹、桃樹、蘋果等許多植物中已對(duì)GRF基因家族進(jìn)行了鑒定及功能分析，上述研究完善了我們對(duì)GRF基因家族的認(rèn)識(shí)，但該家族在橡膠樹中的研究及功能分析尚未見報(bào)道。本研究經(jīng)克隆得到HbGRF基因，運(yùn)用生物信息學(xué)和基因表達(dá)等方法分析HbGRF及其蛋白的基本信息，初步了解HbGRF在橡膠樹生長(zhǎng)發(fā)育過程中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制;利用原位PCR和熒光原位雜交技術(shù)探究HbGRF與其他功能基因之間的位置關(guān)系，這可為橡膠樹精準(zhǔn)育種設(shè)計(jì)提供理論指導(dǎo)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本研究以正常生長(zhǎng)開割10 a的巴西橡膠樹優(yōu)良品種‘熱研7-33-97為材料，采集根、莖、莖尖、葉片、樹皮、果實(shí)、雌花以及不同發(fā)育時(shí)期的花序。實(shí)驗(yàn)材料由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家橡膠樹種質(zhì)資源圃提供。

外源赤霉素（GA）和脫落酸（ABA）處理所用材料為1 a的‘熱研7-33-97組培苗，每個(gè)處理組設(shè)置5棵幼苗。GA處理：對(duì)植株噴施濃度為200 ?mol/L的GA，使用過程中以無水乙醇溶解GA后噴施處理植株，并以噴施等濃度乙醇處理的植株為對(duì)照，分別采集處理0、0.5、2、6、12、24、48 h植株與對(duì)照植株的葉片，ABA處理與GA處理方法相同。以上所有材料取樣后用液氮速凍，保存至-80 ℃冰箱中備用。

1.2 ?方法

1.2.1 ?橡膠樹HbGRF基因的克隆 ?根據(jù)GRF家族基因的保守序列，在橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫（http：//hevea.catas.cn）中做同源序列搜索，通過CDS編碼區(qū)預(yù)測(cè)和序列拼接得到橡膠樹HbGRF1、HbGRF2、HbGRF3基因的cDNA序列。運(yùn)用Primer Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1）。用反轉(zhuǎn)錄得到的橡膠樹雌花cDNA為模板，對(duì)橡膠樹HbGRF基因家族的HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3 3個(gè)成員的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 ?L，其中包括Prime STAR Max Premix（2×）10 ?L，cDNA模板1 ?L，上、下游引物各0.4 ?L，滅菌的ddH2O 8.2 ?L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后于72 ℃延伸10 min。使用OMEGA公司的凝膠回收試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收純化后與pMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，挑選陽性克隆重組子交華大基因公司測(cè)序。

1.2.2 ?橡膠樹HbGRF基因的生物信息學(xué)分析 ?HbGRF基因的編碼區(qū)序列及氨基酸序列的比對(duì)和預(yù)測(cè)分析是通過NCBI中的BLAST軟件和ORF Finder軟件完成，其所編碼蛋白的理化特性通過ExPASy ProtParam在線分析[20]。HbGRF蛋白的亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、編碼蛋白的跨膜區(qū)段及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，分別采用PSORT、SignalP、TMpred及SMART軟件進(jìn)行分析。使用PredictProtein軟件對(duì)HbGRF基因家族編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。使用DNAMAN 6.0軟件對(duì)近源物種的HbGRF蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析。使用MEGA 7.0軟件對(duì)HbGRF蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.2.3 ?橡膠樹HbGRF基因在染色體上的物理定位

（1）染色體標(biāo)本的制備：參照高和瓊等[21]、李懋學(xué)等[22]和張志丹等[23]的實(shí)驗(yàn)方法，選取古銅期幼葉進(jìn)行染色體標(biāo)本的制備，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）特異性引物的合成與篩選：依據(jù)克隆得到的測(cè)序結(jié)果，對(duì)序列片段進(jìn)行分析，參照代素珍等[24]的方法對(duì)HbGRF基因進(jìn)行合成與篩選，將PCR的退火溫度調(diào)整為45～65 ℃，通過凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，選取條帶單一、明亮的產(chǎn)物交華大基因公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與基因序列比對(duì)，共篩選出3對(duì)符合條件的特異性引物（表1）。

（3）原位PCR：參照官錦燕等[25]的原位PCR方法進(jìn)行改進(jìn)，對(duì)HbGRF1和HbGRF2基因進(jìn)行檢測(cè)。

（4）熒光原位雜交：將PCR擴(kuò)增得到的HbGRF3基因的擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，用地高辛切口平移試劑盒DIG-Nick Translation Mix將其標(biāo)記成探針，信號(hào)位點(diǎn)呈現(xiàn)綠色;標(biāo)記好的探針溶于100%去離子甲酰胺溶液中，且終濃度為50 ng/?L;將標(biāo)記好的探針置于-20 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?。熒光原位雜交的方法參照本課題組邱海燕[26]報(bào)道的方法進(jìn)行檢測(cè)。

（5）鏡檢與分析：將40 ?L含有DAPI染料的抗褪色劑滴加至染色體標(biāo)本上進(jìn)行封片，在黑暗環(huán)境中放置60 min后，使用Leica DM5000顯微鏡進(jìn)行觀察與拍照;用Photoshop軟件對(duì)所拍照片進(jìn)行處理，使用Image J軟件對(duì)染色體長(zhǎng)度及信號(hào)位點(diǎn)距著絲粒的距離進(jìn)行測(cè)量，并利用擴(kuò)增信號(hào)位點(diǎn)百分距離的計(jì)算方法[27]，結(jié)合‘熱研7-33-97的核型分析參數(shù)[28]，分析和確定信號(hào)位點(diǎn)在染色體上的位置。

擴(kuò)增信號(hào)位點(diǎn)的百分距離=?×100

1.2.4 ?橡膠樹HbGRF基因的表達(dá)分析 ?依據(jù)橡膠樹HbGRF基因的ORF區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量引物，使用TIANGEN試劑盒提取RNA，用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1條鏈，以各樣品的cDNA為模板，濃度統(tǒng)一稀釋為100 ng/?L，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物見表1，對(duì)HbGRF基因在不同組織、不同發(fā)育時(shí)期及不同外源激素處理后的表達(dá)情況進(jìn)行qRT-PCR分析，以巴西橡膠樹18S rRNA為內(nèi)參，采用2ΔΔCT法進(jìn)行定量分析，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，定量數(shù)據(jù)使用SAS 9.1.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[29]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?橡膠樹HbGRF基因的克隆和蛋白序列分析

以巴西橡膠樹‘熱研7-33-97雌花cDNA為模板，使用特異性引物克隆得到3個(gè)片段大小分別為1830、1155、1485 bp的基因。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因片段和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后的序列一致，將這3個(gè)基因分別命名為HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3，其登錄號(hào)分別為：MN396751、MN396752和MN396753。

運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)巴西橡膠樹3個(gè)HbGRF基因進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明其編碼384～609個(gè)氨基酸，分子量大小范圍為41.188～ 65.663 kDa，等電點(diǎn)為6.09～8.77，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為51.08～56.06，均為不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為57.98～69.03，疏水性平均系數(shù)范圍為0.541～ 0.582（表2）。對(duì)HbGRF蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)GRF蛋白均處在細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子的特征相符合。

通過Predict Protein在線軟件對(duì)HbGRF1、HbGRF2、HbGRF3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示這3個(gè)蛋白都含有DNA結(jié)合區(qū)和多個(gè)蛋白結(jié)合區(qū)域（圖1），說明它們可能在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用。

紅色條帶：螺旋結(jié)構(gòu);藍(lán)色條帶：鏈;黃色條帶：隱藏結(jié)構(gòu);綠色條帶：無規(guī)律結(jié)構(gòu);紅色小方塊：蛋白結(jié)合區(qū);黃色小圓圈：DNA結(jié)合區(qū);紫色小圓圈：RNA結(jié)合區(qū);灰色小圓圈：核苷酸結(jié)合區(qū)。

2.2 ?橡膠樹HbGRF蛋白的多重比對(duì)及進(jìn)化分析

對(duì)HbGRF的蛋白序列和近緣物種如木薯（Manihot esculenta）、可可樹（Theobroma cacao）以及麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）的GRF蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，橡膠中的3個(gè)HbGRF基因家族成員均含有QLQ和WRC保守結(jié)構(gòu)域，QLQ結(jié)構(gòu)域的序列是QX3LX2Q，WRC結(jié)構(gòu)域的序列是CX9CX10CX2H，在橡膠HbGRF家族的3個(gè)成員中，WRC結(jié)構(gòu)域比QLQ結(jié)構(gòu)域更為保守（圖2），表明這3個(gè)橡膠樹HbGRF蛋白均含有特有的GRF結(jié)構(gòu)域。

進(jìn)一步選取木薯、可可樹、水稻、擬南芥、麻風(fēng)樹等已知的GRF家族基因使用MEGA 6.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，在植物中GRF家族基因可以分成5個(gè)亞族（Ⅰ～Ⅴ）（圖3）。其中橡膠樹的HbGRF1、HbGRF2、HbGRF3基因分別屬于Ⅰ亞族、Ⅱ亞族、Ⅳ亞族，且HbGRF1與HbGRF3基因親緣關(guān)系略近。

2.3 ?HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因的物理定位分析

分別用HbGRF1和HbGRF2基因定位的特異引物與Digoxigenin-11-dUTP等配制成擴(kuò)增液，在制備好的染色體標(biāo)本上進(jìn)行原位PCR反應(yīng)和熒光檢測(cè)。在有絲分裂的間、前、中期的染色體上均能觀察到2個(gè)綠色熒光信號(hào)點(diǎn)（圖4，圖5）。陰性對(duì)照組中不加入Taq酶，其細(xì)胞染色體上均未出現(xiàn)信號(hào)（圖4D，圖5D）。對(duì)信號(hào)位點(diǎn)所在的中期細(xì)胞進(jìn)行核型分析，得到信號(hào)位點(diǎn)與染色體的對(duì)應(yīng)關(guān)系，以及信號(hào)位點(diǎn)在核型模式圖上的位置關(guān)系。結(jié)果表明，HbGRF1和HbGRF2基因分別位于第11號(hào)染色體長(zhǎng)臂和第5號(hào)染色體短臂上，基因到著絲粒的平均百分距離分別是77.65和42.66。

用地高辛對(duì)HbGRF3基因的擴(kuò)增純化產(chǎn)物標(biāo)記為探針，隨后采用熒光原位雜交進(jìn)行檢測(cè)，在有絲分裂的間、前、中期的染色體上均能觀察到2個(gè)綠色熒光信號(hào)點(diǎn)（圖6），陰性對(duì)照組中不加入探針，其細(xì)胞染色體上均未出現(xiàn)信號(hào)（圖6D）。對(duì)信號(hào)位點(diǎn)所在的中期細(xì)胞進(jìn)行核型分析，得到信號(hào)位點(diǎn)與染色體的對(duì)應(yīng)關(guān)系，以及信號(hào)位點(diǎn)在核型模式圖上的位置關(guān)系（圖7）。結(jié)果表明，HbGRF3位于第9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，基因到著絲粒的平均百分距離是65.27。

2.4 ?橡膠樹HbGRF基因的表達(dá)分析

2.4.1 ?橡膠樹HbGRF基因在不同組織中的表達(dá)分析 ?為進(jìn)一步研究橡膠樹HbGRF基因在生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用，本研究使用qRT-PCR技術(shù)對(duì)橡膠樹根、莖、莖尖等8個(gè)組織或器官中HbGRF基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。由圖8可知，HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因在植株8個(gè)不同部位中表達(dá)量有差異。其中，HbGRF1基因在莖尖、雌花中高調(diào)表達(dá)，在其他部位表達(dá)量較低。HbGRF2和HbGRF3基因在莖尖中顯著高調(diào)表達(dá)，在雌花中的表達(dá)量也比別的部位高。由此推測(cè)HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因可能參與橡膠樹花芽分化及雌花的發(fā)育過程。

2.4.2 ?橡膠樹HbGRF基因在不同發(fā)育時(shí)期花序中的表達(dá)分析 ?對(duì)橡膠樹HbGRF基因在花蕾期（花序長(zhǎng)度約為3 cm）、伸展期（花序長(zhǎng)度約為6 cm）、盛花期（花序長(zhǎng)度約為9 cm）和開花末期（花序長(zhǎng)度約為12 cm）等4個(gè)花序發(fā)育階段的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在伸展期，HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因的表達(dá)量最高，由此推測(cè)HbGRF基因在生長(zhǎng)發(fā)育較為活躍的部位表達(dá)較強(qiáng)（圖9）。

2.4.3 ?橡膠樹HbGRF基因在外源激素處理下的表達(dá)分析 ?使用外源赤霉素對(duì)橡膠樹幼葉進(jìn)行處理后，HbGRF1和HbGRF2在處理后0.5 h、HbGRF3在處理后6 h時(shí)，其表達(dá)量最高;使用外源脫落酸處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)基因均在處理后0.5 h時(shí)，表達(dá)量達(dá)到了最高值。當(dāng)2種外源激素處理后48 h時(shí)，3個(gè)基因的表達(dá)量和初始條件下的表達(dá)量基本相同（圖10）。

3 ?討論

GRF基因家族是一類成員數(shù)目較多的轉(zhuǎn)錄因子家族，該轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程具有重要的調(diào)控作用。目前，GRF基因家族在水稻、擬南芥、楊樹、番茄、陸地棉、油菜、煙草、桃樹、茶樹、藜麥等多種植物中已有研究，但對(duì)于具有重要戰(zhàn)略意義的橡膠樹GRF基因的相關(guān)研究仍缺乏進(jìn)一步的報(bào)道。本研究從橡膠樹中克隆到3個(gè)HbGRF基因，首先對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)與表達(dá)模式等分析，再使用原位PCR技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行了物理定位分析，試圖從分子生物學(xué)及細(xì)胞學(xué)的角度對(duì)功能基因進(jìn)行較為全面的研究。

伴隨基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與完善，Livak等[29]對(duì)橡膠樹‘熱研7-33-97的全基因組進(jìn)行了測(cè)序，這對(duì)橡膠樹基因家族的分析與鑒定、功能基因的挖掘與研究都提供了很多便利，預(yù)測(cè)了43 792個(gè)蛋白編碼基因，其中包括7個(gè)預(yù)測(cè)的橡膠樹GRF基因，較為符合一般植物中GRF基因家族含有8～20個(gè)成員的規(guī)律。本研究根據(jù)擬南芥GRF的2個(gè)保守序列QLQ和WRC，在橡膠數(shù)據(jù)庫搜索到7個(gè)基團(tuán)，然后設(shè)計(jì)引物，以橡膠樹總cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，只擴(kuò)增出3個(gè)基因，推測(cè)可能是其他基因的豐度比較低等原因造成。將本研究中擴(kuò)增的3個(gè)HbGRF基因和預(yù)測(cè)的7個(gè)橡膠樹GRF基因的序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HbGRF1配對(duì)序列的一致性為99.84%，其余均完全比對(duì)，說明該比對(duì)結(jié)果與Tang等[30]的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

對(duì)3個(gè)HbGRF基因的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)成員均含有QLQ和WRC 2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，且WRC結(jié)構(gòu)域的特異性較高，這與藜麥、茶樹等植物中的研究相一致。對(duì)橡膠樹與其他植物GRF的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，可將GRF分為5個(gè)亞族，其中HbGRF1與MeGRF1、HbGRF2與JcGRF3、HbGRF3與AtGRF8親緣關(guān)系較近，基因之間的親緣關(guān)系越接近，其功能可能也越類似。如擬南芥中的AtGRF8基因在花的發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用，尤其是在花器官發(fā)育后期。HbGRF3基因在橡膠樹雌花中的表達(dá)量相對(duì)較高，由此推測(cè)橡膠樹HbGRF3基因在花的發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用。

前人研究結(jié)果表明，GRF基因家族的成員在發(fā)育活躍的器官或組織中表達(dá)量較高，在成熟的組織或器官中表達(dá)量相對(duì)較低。在茶樹中CsGRF在生長(zhǎng)比較旺盛的組織尤其是芽葉中起到了重要的調(diào)控作用[15]。在油菜中BnGRF可調(diào)控花器官的發(fā)育[31]。本研究對(duì)3個(gè)HbGRF基因在不同部位的表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)，它們?cè)谇o尖及雌花中的表達(dá)量相對(duì)較高，推測(cè)這3個(gè)基因參與了調(diào)控橡膠樹花芽分化以及雌花發(fā)育的過程。對(duì)HbGRF在花序不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其在伸展期表達(dá)量最高，符合GRF轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)，但在開花末期，3個(gè)基因的表達(dá)量也相對(duì)較高，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因及機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)行更深入的研究。在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐過程中，橡膠樹座果率較低，一般為5%～8%，最高不超過10%，這是橡膠樹常規(guī)育種工作效率較低的原因之一。赤霉素信號(hào)途徑在調(diào)控植物株高、開花方面有著重要的作用，脫落酸信號(hào)途徑在植物多種生理反應(yīng)及基因的脅迫應(yīng)答方面具有重要的調(diào)控作用。前人的研究發(fā)現(xiàn)，蘋果樹MdGRF基因可能在外源激素作用下調(diào)控蘋果樹的生長(zhǎng)，在調(diào)控嫁接到矮化砧木上接穗的生長(zhǎng)以及2個(gè)品種節(jié)間伸長(zhǎng)等過程中有著重要的作用[32]。本研究用外源赤霉素和外源脫落酸對(duì)橡膠樹進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量在處理后0.5～6 h內(nèi)達(dá)到最高，在外源激素處理后48 h時(shí)，3個(gè)基因的表達(dá)量回落到初始水平，表明HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3受赤霉素和脫落酸處理的調(diào)控。

基因定位的結(jié)果表明，HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3定位在3條不同的染色體上，它們之間可能相互獨(dú)立，結(jié)合本課題組已報(bào)道的橡膠樹其他功能基因的定位結(jié)果可以得知，HbGRF1與OVP-10390[33]、Hevb7[34]同時(shí)位于第11號(hào)染色體上;HbGRF2與HbMyb1[35]、HbN1N1[36]、HbNAC1[37]、HbPEPRK2[24]、HblMAC4[38]同時(shí)位于第5號(hào)染色體上;HbGRF3與HbCPT[39]、HbJAZ5[40]、HbNAC3[37]、HblMYC2、HblMYC5[38]、HbWRKY1、HbWRKY4、HbWRKY5[41]同時(shí)位于第9號(hào)染色體上。這些定位在相同染色體上的基因間可能存在互為連鎖的關(guān)系。研究功能基因之間的相互關(guān)系對(duì)了解這些基因間可能存在的遺傳關(guān)系提供了幫助，這些結(jié)果可以為橡膠樹精準(zhǔn)育種設(shè)計(jì)提供理論指導(dǎo)。

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