何曉輝 陳武生 楊珩欽 詹建勇 莊一凡 莊鑫泓 羅輝 秦育濱

骨質(zhì)疏松癥是由于多種原因?qū)е碌墓敲芏群凸琴|(zhì)量下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞，造成骨脆性增加，從而容易發(fā)生骨折的全身性骨病。成骨細(xì)胞主要由內(nèi)外骨膜和骨髓中基質(zhì)內(nèi)的間充質(zhì)始祖細(xì)胞分化而來，是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化[1]。因此，對成骨細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)在骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防及治療中具有非常重要的作用。硼硅酸鹽生物玻璃作為新型的生物材料，不僅能夠通過轉(zhuǎn)化為羥基磷灰石來促進(jìn)骨修復(fù)，還能通過硼酸鹽誘導(dǎo)骨再生的活性來促進(jìn)骨修復(fù)[2]。目前關(guān)于硼硅酸鹽生物玻璃對成骨細(xì)胞增殖分化影響的研究報(bào)道很少見。基于此，本研究將通過探討硼硅酸鹽生物玻璃浸提液對大鼠成骨細(xì)胞的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制，為硼硅酸鹽生物玻璃防治骨質(zhì)疏松癥及促進(jìn)骨修復(fù)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 ROS1728 大鼠成骨細(xì)胞由上海佰曄生物科技中心提供，貨號(hào) :SX-C1200。

1.1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱由德國美墨爾特公司生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)由萊特（南通）科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)由杭州朗基科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；倒置熒光顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產(chǎn)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測系統(tǒng)由美國Bio-Rad 公司生產(chǎn)。

1.1.3 試劑 培養(yǎng)基由上海佰曄生物科技中心生產(chǎn)；CCK-8 試劑盒、堿性磷酸酶染色試劑盒、PCR 試劑盒及Western-blot 試劑盒由英國Abcam 公司生產(chǎn)。

1.1.4 硼硅酸鹽生物玻璃浸提液 將硼硅酸鹽生物玻璃材料的顆粒與高糖DMEM 培養(yǎng)基混合，比例為每3cm2硼硅酸鹽生物玻璃顆粒加入1ml DMEM培養(yǎng)基，37℃條件下孵育浸提24h，收集浸提液、0.22μm 過濾除菌后4℃放置備用。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 成骨細(xì)胞按3×103個(gè)/100μl 接種于96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，加50μg/ml（高劑量組）、25μg/ml（低劑量組）浸提液各200μl 繼續(xù)培養(yǎng)，以不加浸提液的完全培養(yǎng)基為對照組，培養(yǎng)成骨細(xì)胞24、48、72h，每孔加10μl CCK-8 溶液，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2h 后，用酶標(biāo)儀測定450nm吸光度值。

1.2.2 鈣鹽沉積量檢測 成骨細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，加50μg/ml（高劑量組）、25μg/ml（低劑量組）浸提液各200μl 繼續(xù)培養(yǎng)，以不加浸提液的完全培養(yǎng)基為對照組，培養(yǎng)成骨細(xì)胞12、16d。取出培養(yǎng)板去除培養(yǎng)液，用PBS 洗一遍。每孔加入100μl 的樣品裂解液。用槍吹打數(shù)下，使樣品裂解液和細(xì)胞充分接觸。充分裂解后，4℃，14 000g 離心5min，取上清，冰上放置待測。酶標(biāo)儀測量570nm 處的吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的鈣濃度。

1.2.3 堿性磷酸酶染色 成骨細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，加50μg/ml（高劑量組）、25μg/ml（低劑量組）浸提液各200μl 繼續(xù)培養(yǎng)，以不加浸提液的完全培養(yǎng)基為對照組，培養(yǎng)成骨細(xì)胞6、9、12d。去除培養(yǎng)基，用PBS 清洗一次，然后用120μl 裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，4℃，14 000g 離心5min，取上清，按照試劑盒步驟進(jìn)行操作。加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品（50μl），37℃孵育20min 后，每孔加入100μl 反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在405nm 測定吸光度。

1.2.4 RT-PCR 法 成骨細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，加50μg/ml（高劑量組）、25μg/ml（低劑量組）浸提液各200μl繼續(xù)培養(yǎng)，以不加浸提液的完全培養(yǎng)基為對照組，培養(yǎng)成骨細(xì)胞9d。提取總RNA，行RT-PCR 法檢測Wnt3a、β-catenin、BMP2 基因mRNA 的表達(dá)水平。引物序列表見表1。

表1 引物序列表

1.2.5 Western-blot 法 成骨細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h 后，加50μg/ml（高劑量組）、25μg/ml（低劑量組）浸提液各200μl 繼續(xù)培養(yǎng)，以不加浸提液的完全培養(yǎng)基為對照組，培養(yǎng)成骨細(xì)胞9d。提取總蛋白，測定PI3K、p-AKT、RUNX2、beta-actin 蛋白的表達(dá)。一抗：PI3K[Cell Signaling Technology（CST），3358，1∶1000]、p-AKT（CST，4058，1∶1000）、RUNX2（CST，12556，1∶1000）、beta-actin（CST，16275，1∶1000）。二抗：鼠抗（CST，7076，1∶1000），兔抗（CST，7074，1∶1000）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度浸提液對成骨細(xì)胞增殖的影響培養(yǎng)24、48、72h 時(shí)，高劑量組與低劑量組成骨細(xì)胞增殖能力均明顯高于對照組（P＜0.05），高劑量組成骨細(xì)胞增殖能力均明顯低于低劑量組（P＜0.05），見表2。

表2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度浸提液對成骨細(xì)胞增殖的影響（，n=6）

表2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度浸提液對成骨細(xì)胞增殖的影響（，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05

2.2 不同濃度浸提液對成骨細(xì)胞活力的影響培養(yǎng)6、9、12d 時(shí)，高劑量組與低劑量組成骨細(xì)胞活力均明顯高于對照組（P＜0.05）；培養(yǎng)6、9d 時(shí)，高劑量組與低劑量組成骨細(xì)胞活力比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)12d 時(shí)，高劑量組成骨細(xì)胞活力明顯高于低劑量組（P＜0.05），見表3。

表3 堿性磷酸酶染色檢測不同濃度浸提液對成骨細(xì)胞活力的影響（，U/mg，n=6）

表3 堿性磷酸酶染色檢測不同濃度浸提液對成骨細(xì)胞活力的影響（，U/mg，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05

2.3 不同濃度浸提液對成骨細(xì)胞鈣鹽沉積量的影響培養(yǎng)12、16d 時(shí)，高劑量組與低劑量組成骨細(xì)胞鈣鹽沉積量均明顯高于對照組（P＜0.05），高劑量組成骨細(xì)胞鈣鹽沉積量均明顯高于低劑量組（P＜0.05），見表4。

2.4 不同濃度浸提液對成骨細(xì)胞基因mRNA 表達(dá)的影響高劑量組與低劑量組成骨細(xì)胞Wnt3a、β-catenin、BMP2 mRNA 表達(dá)水平均明顯高于對照組（P＜0.05）；高劑量組與低劑量組成骨細(xì)胞Wnt3a mRNA 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高劑量組與低劑量組成骨細(xì)胞β-catenin、BMP2 mRNA 表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

表4 不同濃度浸提液對成骨細(xì)胞鈣鹽沉積量的影響（，μg/ml，n=6）

表4 不同濃度浸提液對成骨細(xì)胞鈣鹽沉積量的影響（，μg/ml，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05

表5 RT-PCR法檢測不同濃度浸提液對Wnt3a、β-catenin、BMP2 基因mRNA 表達(dá)的影響（，n=6）

表5 RT-PCR法檢測不同濃度浸提液對Wnt3a、β-catenin、BMP2 基因mRNA 表達(dá)的影響（，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05

2.5 不同濃度浸提液對成骨細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響高劑量組與低劑量組的成骨細(xì)胞PI3K、p-AKT、RUNX2、beta-actin 蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組（P＜0.05）；高劑量組的成骨細(xì)胞PI3K、RUNX2蛋白表達(dá)水平均明顯高于低劑量組（P＜0.05），高劑量組與低劑量組的成骨細(xì)胞p-AKT、beta-actin 蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 Western-blot 法檢測不同濃度浸提液對成骨細(xì)胞PI3K、p-AKT、RUNX2、beta-actin 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

隨著社會(huì)老齡化加劇，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率已躍居世界各種常見疾病的第7 位，被公認(rèn)為嚴(yán)重的社會(huì)公共健康問題。2018 年中國骨質(zhì)疏松流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示：我國50 歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率為19.2%，65 歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率達(dá)到32.0%[3]。因此，對骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行防治很重要。

生物材料被廣泛應(yīng)用于骨科疾病的臨床治療中，較好的生物相容性及能夠?qū)Τ晒羌?xì)胞增殖分化起到誘導(dǎo)作用，是理想生物材料需要具備的特點(diǎn)[4]。硼硅酸鹽生物玻璃是近年來興起的一種新型生物材料，具有較好的生物活性和降解性能，能夠?yàn)楣墙M織的再生提供生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞因子及空間[5，6]。有研究顯示，硼硅酸鹽生物玻璃能夠通過相關(guān)成骨信號(hào)通路誘導(dǎo)成骨細(xì)胞發(fā)生增殖[7]。為了進(jìn)一步明確硼硅酸鹽生物玻璃影響成骨細(xì)胞增殖分化的機(jī)制，我們通過研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組與低劑量組的成骨細(xì)胞增殖能力、活力及鈣鹽沉積量均明顯高于對照組，說明硼硅酸鹽生物玻璃浸提液能夠明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，利于骨組織的再生與愈合。

Wnt 信號(hào)通路由一系列相互作用的分子組成，這些分子的相互作用及功能可通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化、增殖及功能而間接影響骨形成，若抑制Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)可使成骨細(xì)胞分化進(jìn)程受阻，從而抑制骨形成[8～10]；若誘導(dǎo)Wnt 家族成員表達(dá)則可使成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)增加，促進(jìn)骨形成[11]。研究表明PI3K/AKT 信號(hào)通路在骨生長調(diào)節(jié)中通過調(diào)節(jié)堿性磷酸酶、骨鈣蛋白和p-AKT 的表達(dá)發(fā)揮重要作用[12～15]。本研究中，與對照組比較，高劑量組與低劑量組的成骨細(xì)胞Wnt3a mRNA及PI3K、p-AKT、RUNX2、beta-actin 蛋白表達(dá)水平均明顯增高，說明硼硅酸鹽生物玻璃浸提液能夠上調(diào)Wnt 信號(hào)通路及PI3K/AKT 信號(hào)通路，對成骨細(xì)胞有保護(hù)作用。

綜上所述，硼硅酸鹽生物玻璃浸提液能夠促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖分化，提高鈣鹽沉積量，其機(jī)制可能為通過激活Wnt 及PI3K/AK 信號(hào)通路而發(fā)揮作用。但是沒有確定最優(yōu)濃度，還需要進(jìn)一步深入研究。