邵婷如 陳細(xì)婷 鄭則楠 黃光釗 呂曉智

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔頜面外科，廣東 廣州 510515)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是最常見的口腔惡性腫瘤[1-2]，不僅嚴(yán)重破壞患者口腔頜面部的外形，影響美觀及吞咽、咀嚼和語言等功能，還危及患者生命安全[2-3]。盡管OSCC發(fā)病位置相對(duì)表淺，但臨床上大多數(shù)患者就診時(shí)已是晚期。雖然目前放療、化療、手術(shù)治療、靶向治療和免疫治療等已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但晚期OSCC的治療效果并不滿意，晚期OSCC患者的5年生存率為40%～50%[4-5]。因此，OSCC的早期和精準(zhǔn)診斷對(duì)于提高OSCC患者的預(yù)后至關(guān)重要。

前期通過對(duì)OSCC及癌旁配對(duì)正?？谇火つそM織標(biāo)本基因芯片進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(lncRNA)AC007271.3在OSCC中異常高表達(dá)[6]，并可通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)OSCC的生長、侵襲以及遷移[7]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA AC007271.3由OSCC腫瘤細(xì)胞分泌，在OSCC患者的血清中呈穩(wěn)定表達(dá)，并且手術(shù)后患者血清中的AC007271.3顯著降低，提示AC007271.3可能是一種有效的OSCC腫瘤診斷標(biāo)志物[6-7]。而鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)、癌胚抗原(CEA)以及腫瘤特異性生長因子(TSGF)是目前臨床常用的腫瘤診斷標(biāo)志物[8-10]。本課題組前期的研究曾發(fā)現(xiàn)AC007271.3、SCCA及TSGF在OSCC患者血清中異常表達(dá)，對(duì)OSCC具有一定的臨床診斷價(jià)值[6]，但是研究的樣本量相對(duì)較少，因此本研究進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，通過比較OSCC患者以及健康者血清中AC007271.3、SCCA、TSGF和CEA的表達(dá)情況，探討上述腫瘤標(biāo)志物對(duì)OSCC患者早期診斷及預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇我院2014年9月—2019年9月收治并診斷為OSCC的患者共160例作為研究組(所有患者入組前均未接受過放化療或其他抗腫瘤治療，并經(jīng)我院病理檢查確診為OSCC且均為原發(fā)病灶)，其中Ⅰ～Ⅱ期OSCC患者97例，Ⅲ～Ⅳ期OSCC患者63例；另選擇同期于我院體檢健康者160例作為對(duì)照組。本項(xiàng)研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)：AF/SC-09/03.2)。

1.2 研究方法

1.2.1一般資料的收集 收集OSCC患者的一般資料，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤TNM分期、腫瘤病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。

采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)所有研究對(duì)象血清中AC007271.3的表達(dá)水平。使用TRIzol LS試劑(Ambion公司，Waltham，MA，美國)自患者血清中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A,Takara公司,日本)以及熒光定量試劑盒(RR820A,Takara公司,日本)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。采用StepOne Plus實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行兩步法擴(kuò)增反應(yīng)，數(shù)據(jù)經(jīng)導(dǎo)出后，采用2-△△CT法進(jìn)行分析。具體引物序列見表1。

表1 引物名稱和序列

1.3 血清中各指標(biāo)診斷價(jià)值的評(píng)估

通過ROC曲線下面積(AUC)、診斷特異度及診斷靈敏度分別評(píng)估AC007271.3、SCCA、TSGF、CEA單獨(dú)檢測(cè)以及各標(biāo)志物間聯(lián)合檢測(cè)對(duì)OSCC的診斷價(jià)值。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型及Kaplan-Meier生存曲線評(píng)估AC007271.3高表達(dá)和低表達(dá)與OSCC患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0(IBM, Armonk, NY, USA)及GraphPad Prism 5.0(La Jolla, CA, USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。同組樣本間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)或方差分析，組間比較采用非參數(shù)Mann-WhineyU檢驗(yàn)或Welch檢驗(yàn)。聯(lián)合檢測(cè)采用二元Logistic回歸分析，通過ROC曲線評(píng)估各指標(biāo)的診斷價(jià)值。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型及Kaplan-Meier生存曲線分析OSCC患者預(yù)后情況。所有檢測(cè)均為雙尾，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清中AC007271.3、SCCA、TSGF、CEA水平與OSCC患者臨床病理特征的關(guān)系

實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，研究組和對(duì)照組患者的血清中AC007271.3表達(dá)水平分別為914.3±313.2、1.840±0.3419，研究組顯著高于對(duì)照組(t=2.598,P<0.05)。并且Ⅲ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期OSCC患者血清中AC007271.3的表達(dá)水平呈明顯差異(t=2.547,P<0.05)。腫瘤不同TNM分期、不同分化程度、有無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC患者血清中AC007271.3、TSGF及SCCA的表達(dá)差異具有顯著性(t=2.239～4.209,P<0.05)。另外，AC007271.3表達(dá)同時(shí)與患者是否吸煙有關(guān)(t=2.598,P<0.05)。而血清中CEA表達(dá)與OSCC患者臨床病理特征無明顯關(guān)系(P>0.05)。見表2。

表2 血清中不同檢測(cè)指標(biāo)與OSCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.2 血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)對(duì)OSCC診斷價(jià)值

AUC顯示，AC007271.3對(duì)OSCC的診斷價(jià)值最高(AUC為0.877)，診斷靈敏度為80.0%，診斷特異度為83.1%，其次為SCCA(AUC為0.792)，診斷靈敏度為66.9%，診斷特異度為87.5%(圖1)。AC007271.3+SCCA、AC007271.3+TSGF以及AC007271.3+CEA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)OSCC診斷價(jià)值均高于SCCA、TSGF、CEA的單獨(dú)檢測(cè)(圖2)。其中，SCCA+AC007271.3聯(lián)合檢測(cè)對(duì)OSCC的診斷價(jià)值最高(AUC為0.927)，診斷靈敏度為80.6%，診斷特異度為92.5%；AC007271.3+SCCA+TSGF聯(lián)合檢測(cè)診斷特異度較SCCA+AC007271.3聯(lián)合檢測(cè)低，但其曲線下面積更具優(yōu)勢(shì)(AUC為0.932)(表3)；同時(shí)SCCA+AC007271.3聯(lián)合檢測(cè)對(duì)Ⅰ～Ⅱ期OSCC的診斷價(jià)值最高(AUC為0.960)。生存分析研究結(jié)果顯示，血清中AC007271.3高表達(dá)OSCC患者預(yù)后較差(χ2=4.792，HR=2.507，95%CI=1.097～4.206,P<0.05)(圖3)。

圖1 血清中AC007271.3、SCCA、TSGF、CEA診斷OSCC的ROC曲線

a、b、c分別為SCCA、TSGF、CEA單獨(dú)檢測(cè)及其與AC007271.3聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線

圖3 血清中AC007271.3表達(dá)水平與OSCC患者總生存率的關(guān)系

表3 OSCC患者血清中不同檢測(cè)指標(biāo)診斷價(jià)值的評(píng)估

3 討 論

目前研究證明，lncRNA是一類位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，長度大于200個(gè)核苷酸的不具有可讀框的轉(zhuǎn)錄本，在組蛋白乙?；⒒蚣谆?、轉(zhuǎn)錄后翻譯等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因子[11-13]。同時(shí)研究表明，lncRNAs可以從腫瘤組織釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，在癌癥患者的血液、尿液和唾液中均可檢測(cè)到，由此提示一些游離lncRNA可能攜帶與腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移等有關(guān)的信號(hào)因子，可作為潛在的腫瘤標(biāo)志物[14-18]。血清中的循環(huán)lncRNAlinc00152、CFLAR-AS1以及POU3F3均可作為人食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的腫瘤標(biāo)志物[19-21]。胃癌患者血清中的循環(huán)lncRNAAK001058、INHBA-AS1、MIR4435-2HG、UCA1和CEBPA-AS1的水平顯著高于健康對(duì)照組[22]。而關(guān)于OSCC患者血清中l(wèi)ncRNA檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道較少。

前期研究證實(shí)，AC007271.3在OSCC組織中異常表達(dá)，由OSCC細(xì)胞進(jìn)行分泌，在OSCC患者血清中穩(wěn)定表達(dá)，并且手術(shù)以后OSCC患者血清中AC007271.3表達(dá)水平顯著降低，是OSCC液體活檢的一個(gè)潛在腫瘤標(biāo)志物。本研究擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步檢測(cè)AC007271.3及幾種傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物SCCA、CEA和TSGF在研究組及對(duì)照組血清中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，研究組患者血清中AC007271.3的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AC007271.3的表達(dá)水平分別與患者吸煙史、腫瘤TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且其表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差，提示AC007271.3可作為OSCC診斷及預(yù)后評(píng)估的新型腫瘤標(biāo)志物。這些結(jié)果與本課題組前期研究結(jié)果一致[6]，進(jìn)一步提示了AC007271.3在OSCC患者精準(zhǔn)診斷和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

目前臨床診斷OSCC的腫瘤標(biāo)志物較少，傳統(tǒng)的血清標(biāo)志物如SCCA、TSGF、CEA等已被用作多種腫瘤早期診斷的臨床標(biāo)志物[23]。研究表明，血清SCCA是一種診斷特異度較高可用于鱗癌診斷的腫瘤標(biāo)志物，其血清水平與腫瘤進(jìn)程相關(guān)，術(shù)后患者血清SCCA水平較術(shù)前顯著降低，而50%患者血清SCCA水平升高可先于臨床診斷復(fù)發(fā)，但其診斷靈敏度不高[6-7,24]。本研究中，血清中SCCA水平與OSCC患者腫瘤TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，ROC曲線分析提示SCCA對(duì)OSCC患者診斷特異度較高，但其診斷靈敏度欠佳，與文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果基本一致[24]。TSGF是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物，在急性炎癥、膠原疾病和其他臨床疾病中血清水平均較高[25]。本研究發(fā)現(xiàn)TSGF在Ⅲ～Ⅳ期、有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后病理提示腫瘤為低分化的OSCC患者血清中顯著高表達(dá)。CEA也是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物，但其診斷特異度不強(qiáng)，診斷靈敏度不高，對(duì)早期頭頸部惡性腫瘤診斷價(jià)值不大[26]。本研究中血清中CEA的表達(dá)與OSCC患者臨床病理特征并無明顯差異。由于單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)診斷靈敏度和診斷特異度具有一定局限性，而且傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的水平通常受到許多其他疾病和因素的影響[27]。因此，本研究又進(jìn)一步采用ROC曲線分析AC007271.3及SCCA、CEA和TSGF聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于OSCC患者的診斷價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AC007271.3+SCCA聯(lián)合檢測(cè)以及AC007271.3+SCCA+TSGF聯(lián)合檢測(cè)的價(jià)值均高于單獨(dú)檢測(cè)AC007271.3、SCCA和TSGF，其中，AC007271.3+SCCA+TSGF聯(lián)合檢測(cè)對(duì)OSCC具有較高的診斷靈敏度和診斷特異度，診斷價(jià)值最高，和本課題組前期研究結(jié)果一致[6]。這為臨床OSCC患者的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供了一種新的策略，有利于提高對(duì)OSCC患者的早期診斷和預(yù)后評(píng)估。

綜上所述，本文研究的結(jié)果提示血清中的AC007271.3、SCCA以及TSGF是OSCC患者精準(zhǔn)診斷、治療、預(yù)后評(píng)估的腫瘤標(biāo)志物，同時(shí)聯(lián)合檢測(cè)AC007271.3+SCCA+TSGF可以有助于提高對(duì)OSCC患者診斷效率，可為OSCC的早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供參考。