周洲 李玉芝 卞敏霞 葛興云 于金華

(南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科，江蘇 南京 210029)

牙本質(zhì)的仿生再礦化是一種在仿生分子的調(diào)控下，模擬生物自然礦化過(guò)程，是在脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)或晶體表面形成新礦化物質(zhì)，從而修復(fù)脫礦區(qū)的微創(chuàng)治療手段[1-3]。牙本質(zhì)仿生再礦化不但可以治療牙本質(zhì)過(guò)敏，還可以阻止齲病的早期發(fā)展，起到防齲護(hù)齒的作用[4-6]。

仿生再礦化與仿生分子的選擇密切相關(guān)，酪蛋白磷酸肽-納米無(wú)定形磷酸鈣(CPP-ACP)是從牛奶中經(jīng)胰蛋白酶消化提取出來(lái)的多肽復(fù)合物[7]，是一種具有良好的生物相容性的仿生分子，可使鈣和磷酸根離子保持過(guò)飽和濃度從而進(jìn)入牙體脫礦區(qū)，起到抑制牙體脫礦以及促進(jìn)再礦化的作用[8-10]。CPP-ACP以往多用于牙釉質(zhì)的再礦化中，并取得了一定的再礦化效果[11-13]，但在牙本質(zhì)的再礦化中報(bào)道較少，可能是由于單獨(dú)使用CPP-ACP無(wú)法模擬牙本質(zhì)的生物自然礦化過(guò)程，從而無(wú)法獲得理想的再礦化效果。三聚磷酸鈉(TPP)是一種無(wú)定形水溶性線狀聚磷酸鹽，不僅具有良好的生物相容性，同時(shí)也可以作為牙本質(zhì)非膠原蛋白仿生類似物即仿生分子使用。TPP可以通過(guò)磷酸化牙本質(zhì)膠原纖維，增加膠原表面成核位點(diǎn)來(lái)誘導(dǎo)膠原礦化，實(shí)現(xiàn)與膠原微纖維的特異性結(jié)合[14-15]。本研究旨在通過(guò)CPP-ACP在TPP輔助下對(duì)脫礦牙本質(zhì)進(jìn)行仿生再礦化，從而探討再礦化效果?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

CPP-ACP乳劑(GC公司，日本)，TPP(分析純，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司)，35%磷酸凝膠(Gluma Etch 35 Gel，Heraeus公司，德國(guó))，離體牙(南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院外科收集)，人工模擬唾液(以ISO/TR10271為標(biāo)準(zhǔn)配方配置)，衰減全反射傅里葉變化紅外光譜儀(NEXUS670，Nicolet公司，美國(guó))，低速切割機(jī)(Isomet，Buehler公司，美國(guó))，掃描電子顯微鏡(SU3500，HITACHI公司，日本)，能譜分析儀(AZtecEnergy，Oxford Instruments公司，英國(guó))，透射電鏡(Tecnai Spirit 120 kV，F(xiàn)EI公司，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1脫礦牙本質(zhì)樣片的制備 收集口腔門(mén)診外科拔除的患者的完整第三磨牙，排除齲壞裂紋等，去除表面牙釉質(zhì)，以慢速切割機(jī)垂直牙長(zhǎng)軸切割制成4 mm×4 mm×1 mm大小的牙本質(zhì)樣片30片，用不同細(xì)度的砂紙依次打磨光滑，放入超聲清洗機(jī)中去離子水超聲清洗5 min，備用。其中6片作為陽(yáng)性對(duì)照不做任何處理；其余24片牙本質(zhì)樣片先以35%磷酸凝膠涂抹表面60 s致牙本質(zhì)脫礦；脫礦的牙本質(zhì)樣片在超聲清洗機(jī)中通過(guò)去離子水清洗，干燥備用。

1.2.2牙本質(zhì)樣片的分組以及處理 將牙本質(zhì)樣片根據(jù)處理方法不同隨機(jī)分成5組，每組各6片。CPP-ACP再礦化組(A組)：將脫礦牙本質(zhì)樣片實(shí)驗(yàn)面均勻涂抹CPP-ACP乳劑2 min，去離子水沖洗干凈后，放入15 mL盛有模擬唾液的試管中，試管置入37 ℃恒溫水浴鍋中，每24 h涂抹3次，每次間隔8 h，每次均更換模擬唾液，共作用21 d，取出牙本質(zhì)樣片，超聲清洗機(jī)中去離子水清洗2 min，干燥后備用；CPP-ACP+TPP聯(lián)合再礦化組(B組)：在A組的基礎(chǔ)上，先將脫礦牙本質(zhì)樣片浸入25 g/L TPP的溶液中2 h，清洗干燥后，再涂抹CPP-ACP 乳劑2 min；單獨(dú)模擬唾液再礦化組(C組)：將脫礦牙本質(zhì)樣片放入15 mL盛有模擬唾液的試劑管中，試管置入37 ℃恒溫水浴鍋中，每24 h更換模擬唾液，作用21 d后將礦化的牙本質(zhì)樣片取出，超聲清洗機(jī)中去離子水清洗2 min，干燥以后備用；陰性對(duì)照組(D組)：脫礦牙本質(zhì)樣片不做任何處理；陽(yáng)性對(duì)照組(E組)：沒(méi)有任何處理的天然牙本質(zhì)樣片。

1.2.3牙本質(zhì)樣片表面的官能團(tuán)檢測(cè)分析 采用衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)對(duì)天然牙本質(zhì)樣片、脫礦牙本質(zhì)樣片、TPP處理的脫礦牙本質(zhì)樣片(脫礦牙本質(zhì)樣片經(jīng)25 g/L TPP溶液浸泡2 h)以及CPP-ACP在TPP輔助下再礦化21 d的脫礦牙本質(zhì)樣片進(jìn)行官能團(tuán)分析，設(shè)定的ATR-FTIR工作參數(shù)如下：分辨率4 cm-1，掃描范圍700～4 000 cm-1，掃描次數(shù)32次。

1.2.4牙本質(zhì)樣片的微觀形態(tài)觀察 處理21 d后的5組牙本質(zhì)樣片經(jīng)干燥、噴金后分別置于掃描電鏡(SEM)下觀察表面微觀形態(tài)變化情況。A、B組牙本質(zhì)樣片經(jīng)脫水、包埋、切片后于透射電鏡(TEM)下進(jìn)行觀察，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為牙本質(zhì)膠原纖維是否出現(xiàn)周期樣“橫紋”的典型纖維內(nèi)再礦化結(jié)構(gòu)。

1.2.5牙本質(zhì)樣片鈣/磷元素摩爾比的檢測(cè) 處理21 d后的5組牙本質(zhì)樣片，每組各取1個(gè)樣片于其表面隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)，通過(guò)X射線能譜分析(EDS)檢測(cè)羥基磷灰石主要成分鈣/磷元素摩爾比。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 牙本質(zhì)樣片表面官能團(tuán)檢測(cè)分析結(jié)果

曲線1代表天然牙本質(zhì)樣片；曲線2代表脫礦牙本質(zhì)樣片；曲線3代表TPP處理的脫礦牙本質(zhì)樣片；曲線4代表CPP-ACP在TPP輔助再礦化21 d后的脫礦牙本質(zhì)樣片

2.2 牙本質(zhì)樣片表面形貌SEM下觀察結(jié)果

SEM下觀察可見(jiàn)，E組牙本質(zhì)小管大部分處于封閉狀態(tài)；D組牙本質(zhì)樣片完成了脫礦，牙本質(zhì)小管基本處于開(kāi)放狀態(tài)；A組牙本質(zhì)樣片表面有較多礦化物沉積，部分牙本質(zhì)小管完成了封閉，但表面礦化物的沉積不均勻；B組在脫礦牙本質(zhì)樣片表面均勻沉積大量再礦化物，牙本質(zhì)小管基本完成了封閉；C組在脫礦牙本質(zhì)樣片表面只見(jiàn)少量再礦化物沉積，幾乎未見(jiàn)有牙本質(zhì)小管封閉(圖2)。

A～E分別為A～E組，1 000倍

2.3 牙本質(zhì)樣片的TEM下觀察結(jié)果

TEM下觀察結(jié)果顯示，A組樣本牙本質(zhì)膠原纖維內(nèi)幾乎未見(jiàn)周期樣“橫紋”結(jié)構(gòu)，B組樣本牙本質(zhì)膠原纖維內(nèi)可見(jiàn)周期樣“橫紋”結(jié)構(gòu)，纖維內(nèi)有晶體物質(zhì)形成(圖3)。

A、B分別為A、B組，B組中白色箭頭所指為出現(xiàn)的周期樣“橫紋”結(jié)構(gòu)，30 000倍

2.4 牙本質(zhì)樣片鈣/磷元素摩爾比檢測(cè)結(jié)果

EDS檢測(cè)結(jié)果顯示，A～E組樣本鈣/磷元素摩爾比分別為1.57±0.03、1.62±0.03、1.51±0.03、1.48±0.05、1.65±0.04，其中B組鈣/磷元素摩爾比顯著高于A、C及D組(F=19.27，P<0.05)；B組與E組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

3 討 論

CPP-ACP作為一種生物相容性較好的仿生分子以往常用在牙釉質(zhì)的再礦化中，并取得了一定的成效，但在牙本質(zhì)的再礦化中應(yīng)用較少，這主要是牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了CPP-ACP作用于牙本質(zhì)再礦化的難度要高于在牙釉質(zhì)中的再礦化[16-17]。牙釉質(zhì)90%以上是由羥基磷灰石等無(wú)機(jī)物構(gòu)成，只有極少量的有機(jī)成分，這種結(jié)構(gòu)特征便于CPP-ACP以鈣、磷酸根離子為原料在脫礦的牙釉質(zhì)表面以殘存磷灰石為模板完成晶胞的生長(zhǎng)和復(fù)制[18-20]。牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于牙釉質(zhì)，除了無(wú)機(jī)成分，還具有大量的有機(jī)成分，其中主要是膠原纖維和非膠原蛋白。在天然牙本質(zhì)再礦化中，再礦化過(guò)程不是簡(jiǎn)單的礦化離子的生長(zhǎng)沉積，而主要是依靠非膠原蛋白調(diào)控鈣、磷酸根離子等以牙本質(zhì)膠原纖維為模板完成有序排列的過(guò)程[21-22]。本研究即是通過(guò)仿生再礦化來(lái)模擬生物自然的再礦化過(guò)程。

單獨(dú)使用CPP-ACP很難完成這種生物的自然礦化，CPP-ACP可以穩(wěn)定鈣、磷酸根離子在過(guò)飽和濃度進(jìn)入脫礦區(qū)，但很難真正進(jìn)入到牙本質(zhì)膠原纖維內(nèi)。要實(shí)現(xiàn)牙本質(zhì)的仿生再礦化，不僅要完成礦化物在膠原纖維表面的沉積，同時(shí)礦化物要能進(jìn)入到膠原纖維內(nèi)部，完成纖維內(nèi)的再礦化[23-25]。TPP作為一種線狀聚磷酸鹽同樣可作為仿生分子，TPP可以磷酸化牙本質(zhì)膠原纖維，并且標(biāo)記膠原纖維的成核位點(diǎn)，即模擬了牙本質(zhì)非膠原蛋白的N端功能團(tuán)[26-27]。在本研究中，首先通過(guò)TPP溶液磷酸化脫礦牙本質(zhì)的膠原纖維，以膠原纖維作為礦化模板并在膠原纖維上標(biāo)記再礦化的成核位點(diǎn)，然后通過(guò)CPP-ACP穩(wěn)定和運(yùn)輸?shù)V化原料到標(biāo)記好的成核位點(diǎn)上，從而模擬自然礦化過(guò)程中晶體的自組裝和排列過(guò)程完成再礦化。

本研究分別從牙本質(zhì)樣片表面官能團(tuán)變化、表面微觀形態(tài)變化、內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變以及礦化后鈣/磷元素成分變化等多方面綜合分析了CPP-ACP在TPP協(xié)同作用下對(duì)脫礦牙本質(zhì)的再礦化效果。結(jié)果顯示CPP-ACP和TPP兩種仿生分子最大限度地模擬了牙本質(zhì)的自然再礦化過(guò)程，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了牙本質(zhì)的纖維內(nèi)和纖維外的再礦化，此礦化方法可作為脫礦牙本質(zhì)的一種精準(zhǔn)、有效的仿生再礦化方法。