孫 娜 謝 晨 高翊博 任晉璇 郁麗娜 嚴(yán) 敏,

（1 徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，徐州221004；2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院麻醉科，杭州310002）

神經(jīng)病理性疼痛是由軀體感覺系統(tǒng)的損傷或疾病所引起的疼痛[1]，大約影響到世界人口的7%[2,3]，多表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏或感覺異常為特征的嚴(yán)重疼痛，病人常常難以忍受。截至2017 年世界上約有4.25 億的糖尿病病人[4]，其中約有一半伴有糖尿病性周圍神經(jīng)病理性疼痛[5]。在一項大規(guī)模的國人調(diào)查中，2.6%的后背痛是由神經(jīng)病變導(dǎo)致的[6]。目前對于神經(jīng)病理性疼痛的治療以抗驚厥藥、抗抑郁藥作為一線藥物，阿片類藥物對神經(jīng)病理性疼痛效果較差，已經(jīng)作為臨床治療疼痛的二線或三線用藥[7～10]。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)和疼痛傳導(dǎo)通路上尤其是外周初級感覺神經(jīng)元和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元在神經(jīng)病理性疼痛狀況下阿片受體表達降低有很大關(guān)系[11]。因此理解阿片受體表達降低的機制對增強嗎啡對神經(jīng)病理性疼痛鎮(zhèn)痛效應(yīng)的改善很有必要。

表觀遺傳學(xué)包括DNA 的甲基化、組蛋白的乙?；⒔M蛋白的甲基化、LncRNA 等[12]，不涉及DNA 序列改變的基因表達和調(diào)控的可逆、可遺傳修飾，在疼痛的產(chǎn)生和維持，以及疼痛由急性期向慢性期轉(zhuǎn)化的過程中扮演著重要的作用[13～16]。作為染色體的基本結(jié)構(gòu)，組蛋白的乙?；瘯拐麠l染色體的結(jié)構(gòu)松散，有利于轉(zhuǎn)錄因子的接近而有利于轉(zhuǎn)錄，然而去乙酰化則會使其結(jié)構(gòu)致密從而不利于轉(zhuǎn)錄[17,18]。最近Liang 等[19]發(fā)現(xiàn)大鼠在炎性痛或神經(jīng)病理性疼痛模型下背根神經(jīng)節(jié)或脊髓背角組蛋白的乙酰化明顯降低。Hou 等[20]發(fā)現(xiàn)在骨癌痛模型下抑制乙?；? (histone deacetylase 2, HDAC2) 的表達增加，會降低痛覺高敏并且能增加KCC2 的表達。因此，在神經(jīng)病理性疼痛情況下，脊髓背角阿片受體 (opioid receptor, MOR)的減少是否也與HDACs 導(dǎo)致的組蛋白乙?；档陀嘘P(guān)有待進一步探討。本研究首次提出在神經(jīng)病理性疼痛情況下，損傷節(jié)段脊髓HDAC2 存在一個穩(wěn)定且明顯的增加，MOR 表達明顯降低。通過應(yīng)用HDAC2 的抑制劑或應(yīng)用一些干擾RNA 技術(shù)降低脊髓背角HDAC2 在神經(jīng)病理性疼痛情況下的增高可以逆轉(zhuǎn)MOR 表達的降低，提高嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，為臨床嗎啡應(yīng)用于神經(jīng)病理性疼痛的治療提供一個參考。

（3）對向美國或其他外國市場出口的產(chǎn)品實行補貼（或有補貼效果的措施），從而實質(zhì)性影響了美國有競爭力的產(chǎn)品在美國市場或其他外國市場的銷售。

方 法

1.主要試劑和儀器

辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA, S1047, Selleck公司），鹽酸嗎啡（沈陽制藥有限公司），戊巴比妥鈉（上海制藥廠），Anti-MOR 抗體（ab10275, Abcam 公司），Anti-GAPDH 抗體（AF0006, Beyotime公司），Anti-HDAC1 抗體（ab19845, Abcam 公司），Anti-HDAC2 抗體（#2540, Cell Signaling Technology公司），Anti-HDAC4 抗體（#2072, Cell Signaling Technology 公司），Anti-HDAC5 抗體（#20458, Cell Signaling Technology 公司），Anti-acetyl-histone H3 抗體（#9649, Cell Signaling Technology 公司）；Anti-Histone H3 抗體（#9715, Cell Signal Technology 公司），Anti-NeuN 抗體（ab104224, Abcam 公司），蛋白印跡膜再生液(Meilunbio)，熱痛刺激儀（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究所）。

2.實驗動物

C57BL/6J 小鼠，雄性，體重20～25 g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。動物置于24±2℃室溫下，12 h/12 h 晝夜節(jié)律，自由攝食攝水。所有實驗動物適應(yīng)環(huán)境2 天后進入實驗。

3. 神經(jīng)病理性疼痛模型

參照文獻[21]坐骨神經(jīng)慢性壓迫性 (chronic constrictive injury, CCI) 神經(jīng)病理性疼痛模型，腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg 麻醉，于右側(cè)股骨中部做縱向切口，分離股二頭肌，暴露坐骨神經(jīng)及其三個分支：腓腸神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓神經(jīng)，用6-0 絲線自坐骨神經(jīng)三叉分支處單向結(jié)扎4 道，松緊適度，以引起腿部肌肉剛出現(xiàn)肌顫觸為佳，間距1 mm。假手術(shù)組和CCI 組相比，只暴露不結(jié)扎，其余步驟均相同。逐層縫合手術(shù)切口。

4. 熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)

采用SPSS 13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用Graphpad Prism 7.0 生成圖表，ImageJ 2.0 處理圖片。所有計量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 (±SEM)表示。多組間比較采用重復(fù)測量的方差分析，兩兩比較采用t 檢驗。P ＜ 0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

5. 嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)

如Mao 等[16]所述，術(shù)后7 天腹腔注射嗎啡1.5 mg/kg。在手術(shù)前（基線潛伏期）和嗎啡注射后30 min（反應(yīng)潛伏期）進行TWL 測量。截止時間定為20，最大可能鎮(zhèn)痛效應(yīng)的百分比 (% MPAE) = [（反應(yīng)潛伏期-基線潛伏期） / （截止時間-基線潛伏期）]×100%。

采用Hylden 等[23]的方法，鞘內(nèi)注射在L5和L6脊柱節(jié)段之間徒手進行。在針頭進入蛛網(wǎng)膜下腔時，可以注意到小鼠尾巴快速輕彈動作。推藥后針頭停留5～10 s，然后拔出。

管線通過地帶，有的地段灌木茂密，為防止清表偏離，應(yīng)嚴(yán)格進行測量控制。根據(jù)選線位置，在管線通過位置每100 m設(shè)置紅色視線標(biāo)志，先進行第一道方向性清表。根據(jù)管道操作工作面寬度和施工便道寬度、現(xiàn)場堆土寬度的要求，確定清表寬度。沿清表方向每間距50 m設(shè)置清表紅色邊線樁且插標(biāo)旗，專人指揮機械進行修整加寬并隨時檢查調(diào)整方向，確保清表線路正確。

6. 免疫熒光

HDAC2 siRNA由上海吉滿生物科技公司合成。siRNA 由Entranster? 在體轉(zhuǎn)染液稀釋，稀釋濃度約為100 pmol/4 μl，每次鞘內(nèi)給藥體積4 μl，術(shù)前30 min 給藥，連續(xù)1、2、3 共3 天。對照組為試劑商提供的陰性對照。稀釋溶劑為Entranster? 在體轉(zhuǎn)染液。HDAC2 siRNA 的序列如下：5'-CCGTGAAGCTGAACCGTCA-3'。

7. Western blot 法

將小鼠斷頭處死，快速取出L3-4節(jié)段脊髓并放入液氮中冷凍，-80℃保存?zhèn)溆??？俁NA 提取：冰上預(yù)冷研缽，將少量約50～100 mg 組織塊置于研缽，加l ml Trizol 于研缽中，加入適量液氮，進行研磨。用移液器收集研磨液于1.5 ml EP 管中，加入0.2 ml 氯仿，蓋緊離心管，劇烈震蕩離心管，靜置2～3 min。4℃下，12 000 g 離心15 min。取上層水相約400 μl于新的離心管，加入0.5 ml 異丙醇，顛倒混勻，15～30℃放置10 min，4℃下12 000 g 離心10 min。棄上清，加入l ml 75%的無水乙醇，漩渦混勻，4℃ 7500 g 離心5 min。棄上清，室溫或真空干燥5～10 min，將RNA 溶于20～30 μl 水中。測濃度和RNA 質(zhì)量：取2 μl 的RNA 于98 μl 的水中，測濃度和OD260/OD280(＞ 1.8)。用1%瓊脂糖凝膠鑒定RNA 有無降解。逆轉(zhuǎn)錄cDNA：取一新的離心管，依次加入下列溶液：總RNA (0.1～5 μg)、隨機引物3 μl、ddH2O 加至12 μl。70℃孵育5 min 后，冰上震蕩2 min。在冰上依次加入下列試劑：5xReaction Buffer 5 μl、10mMdNTP 混 合 物2 μl、逆 轉(zhuǎn) 錄 酶l μl，42℃處理60～90 min，70℃處理10 min，停止反應(yīng)，放置冰上。逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 可繼續(xù)作為PCR 反應(yīng)或保存于-20℃。PCR 反應(yīng)：在冰上按下列順序依次加入：ddH2O 6 μl、2xSYBR Premix Ex TaqTM II Reaction Buffer 10 μl、各蛋白引物0.8 μl、或GAPDH 引物0.8 μl 、cDNA2 μl 、50×ROX Reference Dye 0.4 μl。最終反應(yīng)體系總體積為20 μl。溫度循環(huán)：95℃30 s、95℃5 s、60℃30 s。重復(fù)步驟2～3，共40 循環(huán)、95℃15 s。經(jīng)ABI 公司StepOnePlusV 2.1 軟件分析處理。各引物見表1。

8.熒光定量實時PCR

將小鼠斷頭處死，快速取出L3-4節(jié)段脊髓并放入液氮中，冷凍-80℃保存?zhèn)溆谩５鞍滋崛。罕项A(yù)冷研缽，將少量組織塊置于研缽中，400 μl 裂解液(RIPA:PMSF = 100:1)加入研缽中，倒入適量液氮，研磨均勻，用移液器收集研磨液于1.5 ml EP 管中，冰上靜置30 min 后，4℃13 000 rpm 10 min，取上清于新的1.5 ml EP 管中。按BCA 法測定樣本蛋白濃度后加入5×上樣緩沖液及裂解液調(diào)整到每一份樣本濃度相同，100℃金屬浴高溫變性5 min。取50 μg蛋白樣本在10%的SDS 預(yù)制膠上電泳，電壓分別為濃縮膠80 V，分離膠120 V，濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h 后分別與一抗抗μ 阿片受體(1:1000)，一抗抗乙?；慕M蛋白H3 抗體(1:1000)；一抗抗組蛋白H3 抗體(1:1000)；一抗抗HDAC1 抗體 (1:1000), 一抗抗HDAC2 (1:1000)，一抗抗HDAC4 抗體 (1:1000)，以及一抗抗HDAC5抗體 (1:1000)， 4℃孵育過夜；TBST 振蕩清洗，3×5 min，加入辣根過氧化物酶酶標(biāo)記二抗(1:5000)，室溫振蕩孵育l h；TBST 振蕩沖洗，3×5 min，使用ECLwestern blot 檢測儀器檢測。曝光之后條帶采用蛋白印跡膜再生液振蕩沖洗30 min，之后重復(fù)孵育其他抗體，進行PVDF 蛋白印跡膜的重復(fù)利用。所得條帶經(jīng)Bio-Rad 公司Quantity One 4.6.2 軟件半定量分析處理。

9. 鞘內(nèi)給藥

采訪中，我們還有一個很大的感觸就是，對待做人做事，華岳人講規(guī)則、講規(guī)律?！拔覀冑u的不僅僅是產(chǎn)品，也是服務(wù)、標(biāo)準(zhǔn)和誠信。既是物美價廉的產(chǎn)品，更是個性化、高品質(zhì)的產(chǎn)品。”在他們看來，企業(yè)的發(fā)展，靠的不僅是高質(zhì)的產(chǎn)品，更重要的是注重創(chuàng)新與研發(fā)，做到產(chǎn)品和服務(wù)一體化。

加強水利重大問題研究與應(yīng)用。繼續(xù)加強流域與行業(yè)共性重大問題的調(diào)研論證，組織凝練出一批流域與行業(yè)共性重大科技項目。加強水利重大基礎(chǔ)研究，在行業(yè)科研專項經(jīng)費中，設(shè)立重大基礎(chǔ)研究專項。圍繞南水北調(diào)西線工程建設(shè)前期論證中的重大關(guān)鍵技術(shù)問題，積極爭取科技部設(shè)立重大科技支撐項目支持開展研究。圍繞水旱災(zāi)害綜合治理、節(jié)約用水、水資源保護、水土保持、工程建設(shè)與管理等方面加快科技成果的推廣應(yīng)用。

10. HDAC2 siRNA 給藥

小鼠在深麻醉下，經(jīng)升主動脈依次灌注生理鹽水 (20 ml) 和4%多聚甲醛溶液 (20 ml)。取L3-L4節(jié)段脊髓，在4%多聚甲醛溶液中固定過夜后，轉(zhuǎn)入15%蔗糖溶液，4℃過夜，脫水至組織沉底，再轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液，4℃過夜，脫水至組織沉底。橫向冰凍切片，厚10 μm，貼于防脫陽離子玻片上，免疫組化筆畫圈，加入含有0.3% TritonX-100 的5%牛血清室溫封閉1 h。1 h 后加入含有一抗抗NeuN (1:200)，一抗抗μ 阿片受體(1:200)，一抗抗乙酰化的組蛋白H3 抗體(1:200)； 一抗抗HDAC1 抗體 (1:200)， 一抗抗HDAC2 (1:200)， 一抗抗HDAC4抗體 (1:200)，以及一抗抗HDAC5 抗體 (1:200)，4℃孵育過夜，PBS 沖洗，3×5 min，滴加二抗Alexa FluorTM 594 d 驢抗兔(H + L) (1:500)， Alexa FluorTM488 驢抗鼠(H + L) (1:500)，DAPI 染色液，甘油封片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

11. AAV5-HDAC2 病毒的構(gòu)建

為構(gòu)建表達全長HDAC2 mRNA 的質(zhì)粒，首先通過Trizol 方法從小鼠脊髓組織中提取總RNA，用DNase I 處理。然后擴增HDAC2 cDNA。擴增HDAC2引物序列如下：Forward：CCGCTCGAGGCCACCATGGCGTACAGTCAAGGAGGC；Reverse：GCTCTAGAAGGGTTGCTGAGTTGTTCTGACTTG。接下來，將HDAC2 cDNA 插入前病毒質(zhì)粒 (pAAVMCS) 中。DNA 測序用于驗證cDNA 序列和重組克隆。制備攜帶cDNA 的腺相關(guān)病毒顆粒。使用PEI轉(zhuǎn)染方法，用表達HDAC2 或增強的綠色熒光蛋白 (EGFPr)，pAAV-DJ-RC 和pHelper 的pAAV-MCS 轉(zhuǎn)染DH5a 感受態(tài)細胞。3 天后，收集轉(zhuǎn)染的細胞并懸浮在無血清DMEM 中。在4 次凍融循環(huán)后，以10 000 g 離心10 min 收集AAV 上清液，并使用AAV Puri fication Standard Kit (Cell Biolabs, Inc) 濃縮。

12. 統(tǒng)計學(xué)分析

采用熱輻射刺激儀，測定小鼠損傷側(cè)熱輻射刺激，測定小鼠損傷側(cè)足底TWL。將有機玻璃箱置于3 mm 厚的玻璃板上，按Hargreaves 法[22]用熱輻射刺激儀照射小鼠足底，照射開始至小鼠出現(xiàn)抬腿回避時間為TWL。熱刺激強度調(diào)整為基礎(chǔ)值8～12 s，在整個實驗過程中維持一致，自動切斷時間為20 s，以免造成熱輻射損傷。為避免或減少前一次刺激對隨后刺激效應(yīng)造成的影響，同一部位刺激的間隔時間為2 min，連續(xù)測定3 次，取3 次平均值為小鼠TWL 值。

在本實驗中，小鼠分成CCI 手術(shù)組以及Sham手術(shù)組。在術(shù)后7 天取材小鼠脊髓進行Westernblot、qRTPCR 以及免疫熒光。Western blot 顯示外周神經(jīng)損傷后損傷側(cè)L3-L4節(jié)段脊髓中MOR 蛋白表達降低（見圖1A），HDAC2 蛋白表達增加（見圖1C）。HDAC1、HDAC4 和HDAC5 蛋白表達變化不明顯（見圖1B、D 和E）。神經(jīng)損傷后7 天組蛋白的乙?；矫黠@降低（見圖1F）。qRTPCR 顯示MOR 與HDAC2 mRNA 的變化水平和蛋白水平基本一致（見圖G-K），而HDAC1, 4, 5mRNA 變化不明顯。免疫熒光顯示MOR 主要表達在脊髓背角淺層，HDAC2 主要表達在神經(jīng)元的細胞核，而 AcH3 為廣泛表達的核內(nèi)蛋白（見圖 2）。

結(jié) 果

1. 外周神經(jīng)損傷后小鼠脊髓中MOR 和AcH3表達降低，HDAC2 表達增加

近年來，鋰離子電池的應(yīng)用已經(jīng)逐漸擴展到汽車、家電、電動自行車、儲能等領(lǐng)域。2014年，中國鋰離子電池產(chǎn)量達52.87億只，占全球總產(chǎn)量比重達到71.2%， 2018年預(yù)計全國鋰電池產(chǎn)量達到121億只，增速22.86%。國內(nèi)鋰離子電池產(chǎn)業(yè)進入快速成長階段，成為全球主要的鋰離子電池生產(chǎn)國和消費國。

朱熹曾說過：“無一事而不學(xué)，無一時而不學(xué)，無一處而不學(xué)?！苯K身學(xué)習(xí)是每一個人基本生存素質(zhì)，“嚴(yán)謹(jǐn)篤學(xué)，與時俱進?！笔切率兰o(jì)教師應(yīng)有的終身學(xué)習(xí)觀。數(shù)學(xué)是一門不斷在前進與發(fā)展的科學(xué)，教師只有樹立終身學(xué)習(xí)觀念，不斷地學(xué)習(xí)與進步，才能提高自身的數(shù)學(xué)和數(shù)學(xué)史素養(yǎng)，并能更好地在數(shù)學(xué)課堂中，潛移默化地讓學(xué)生理解、領(lǐng)悟數(shù)學(xué)史并合理利用數(shù)學(xué)史，從而發(fā)揮數(shù)學(xué)史真正的作用。

表1 q-PCR 中的引物序列Table 1 Primers and sequences used in q-PCR

2.降低脊髓HDAC2 的表達可增加MOR 的表達，增強嗎啡的鎮(zhèn)痛作用

圖1 外周神經(jīng)損傷導(dǎo)致小鼠脊髓中MOR 和AcH3 表達降低，HDAC2 表達增加(±SEM) (A-F) Western blot 顯示神經(jīng)損傷7 天后損傷側(cè)L3-L4 節(jié)段脊髓各蛋白的表達量。MOR 和AcH3 表達降低，HDAC2表達增加，HDAC1, 4, 5 變化不明顯，n = 6（表示做了6 次重復(fù)，每組用4 只）；(G-K) qRTPCR 顯示神經(jīng)損傷后脊髓各蛋白的mRNA 的表達量，變化趨勢和蛋白基本一致，n = 4（每組用3 只） *P ＜ 0.05，CCI 組與Sham 組相比Fig. 1 The expression of MOR and AcH3 increased while the expression of HDAC2 decreased 7 days after peripheral nerve injury (±SEM) (A-F) Western blot showed the expression of proteins in segment L3-L4 of the injured spinal cord 7 days after surgery. An obvious decline was shown in the expression of MOR and AcH3 while an augmentation appeared in the expression of HDAC2. No obvious change was found in the expression of HDAC1, HDAC4 and HDAC5. n = 6 (means 6 repetitions, 4 mice in each group); (G-K) qRTPCR showed the level of mRNA after nerve injury, which was parallel with the tendency of the proteins change.n = 4 (3 mice/group). *P ＜ 0.05, CCI group compared with group Sham.

將小鼠分為溶劑Sham 組 (Veh-Sham)，溶劑CCI組 (Veh-CCI) 以及SAHA-CCI 組。在SAHA-CCI 組術(shù)前30 min 鞘內(nèi)注射HDAC 的泛抑制劑SAHA，連續(xù)7 天，以降低HDAC2 表達。在術(shù)后第3 天腹腔注射嗎啡1.5 mg/kg 后30 min 測量小鼠損傷側(cè)熱TWL 值計算嗎啡的MPAE。結(jié)果表明與Veh-Sham組相比，Veh-CCI 組嗎啡的MPAE 明顯降低，說明在神經(jīng)病理性疼痛情況下嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)降低。而鞘內(nèi)注射SAHA3 天后與Veh-CCI 組相比，嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)顯著增加（見圖3A）。Western blot 和qRTPCR 顯示術(shù)后7 天損傷節(jié)段HDAC2 蛋白的表達降低，HDAC2 mRNA 水平降低（見圖3C、F）。同時SAHA 可以增加損傷側(cè)MOR 的蛋白表達量以及促進MOR 基因的轉(zhuǎn)錄（見圖3B、E），增加組蛋白H3 的乙?；剑ㄒ妶D3D）。因此，SAHA對HDAC2 表達的抑制也許能促進MOR 的表達，從而增強嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

3.降低脊髓HDAC2 的表達可增加損傷側(cè)脊髓中的MOR 和AcH3 的表達

將小鼠分為溶劑CCI 組(Veh-CCI)，陰性對照CCI 組(NC-CCI)以及HDAC2 siRNA-CCI 組(Si-CCI)。通過鞘內(nèi)注射HDAC2 siRNA 降低神經(jīng)病理性疼痛情況下脊髓HDAC2 的表達來確定脊髓背角中HDAC2 對MOR 是否有調(diào)節(jié)作用。設(shè)置Veh-CCI組，以排除溶劑的影響。在術(shù)前30 min 鞘內(nèi)注入HDAC2 siRNA 或NC siRNA，連續(xù)3 天。術(shù)后第7天腹腔給嗎啡1.5 mg/kg，30 min 后測量小鼠損傷側(cè)TWL。發(fā)現(xiàn)在Si-CCI 組小鼠中嗎啡的鎮(zhèn)痛作用顯著增加（見圖4）。Western blot 與qRTPCR 顯示，與NC-HDAC2 處理的小鼠相比，在第7 天，siRNA處理組脊髓背角中HDAC2 蛋白和mRNA 水平顯著降低（見圖4C、F），AcH3 的水平顯著增加（見圖4D），MOR的蛋白水平和mRNA水平明顯增加（見圖4B、E）。免疫熒光也顯示應(yīng)用HDAC2 siRNA在降低HDAC2 表達的同時可以明顯增加損傷側(cè)脊髓MOR 和AcH3 的表達。以上結(jié)果表明脊髓背角中HDAC2 的減少可能通過增加MOR 基因啟動子等部位的乙?；瘜?dǎo)致MOR 表達的增加。

4. HDAC2 過表達降低正常小鼠脊髓背角中的MOR 表達

將小鼠分為AAV5-HDAC2 和AAV5-EGFP 組。通過鞘內(nèi)注射AAV5-HDAC2 過表達脊髓內(nèi)HDAC2，以此模擬HDAC2 在神經(jīng)病理性疼痛表達增加的過程。在脊髓L5-6椎間隙鞘內(nèi)注射重組腺相關(guān)病毒5 (AAV5) 來實現(xiàn)在該節(jié)段脊髓背角表達全長HDAC2 (AAV5-HDAC2)。注射后第28 天，和對照組相比，測量小鼠的TWL，計算嗎啡的MPAE，脊髓過表達HDAC2 后嗎啡的鎮(zhèn)痛效能降低（見圖5A），同時，Western blot 和qRTPCR 顯示HDAC2的過表達降低了MOR 和AcH3 的表達水平。單獨應(yīng)用AAV5-EGFP 不會改變MOR 蛋白水平（見圖5B-D）。qRT-PCR 顯示過表達HDAC2 對MOR 的轉(zhuǎn)錄有抑制作用（見圖5E、F）。綜上所述，MOR在神經(jīng)損傷后表達的降低很有可能是由脊髓背角HDAC2 表達增加所導(dǎo)致的。

圖2 免疫熒光顯示MOR 主要表達在脊髓背角淺層I-II，損傷組較對照組表達降低；HDAC2 在脊髓與神經(jīng)元共標(biāo)，神經(jīng)損傷側(cè)表達較對照組增加；AcH3 在脊髓廣泛表達，與細胞核共標(biāo)，神經(jīng)損傷組較對照組表達降低。紅色：目標(biāo)蛋白；綠色：神經(jīng)元；藍色：細胞核 標(biāo)尺= 100 μmFig. 2 IF showed MOR located mainly in the I-II layers of the spinal cord while HDAC2 and AcH3 expressed widely in the spinal cord. Both of them merged well with nucleus. An obvious decrease was shown in the expression of the MOR and AcH3 and the expression of HDAC2 increased in the CCI group 7 days after surgery. red: target protein; green: neurons; blue: nucleus. Scale bar = 100 μm

圖3 降低HDAC2 的表達可增加MOR 的表達，增強嗎啡的鎮(zhèn)痛作用(±SEM) (A)與Veh-Sham 組相比，Veh-CCI 組在術(shù)后3 天嗎啡的最大可能鎮(zhèn)痛效應(yīng)明顯降低，而在鞘內(nèi)連續(xù)給SAHA 后嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)明顯增加，n = 6（每組用6 只）。(B, E) 鞘內(nèi)給SAHA 后7 天脊髓損傷節(jié)段MOR 蛋白的表達增加，MOR mRNA 的水平增加；(C, F) 鞘內(nèi)給SAHA 后7 天，脊髓HDAC2 在蛋白水平和基因轉(zhuǎn)錄水平表達均有明顯下降；(D) SAHA 促進組蛋白的乙酰化水平，n = 6（每組用4 只）；(G) 免疫熒光進一步證實各蛋白在鞘內(nèi)注射SAHA7 天后在脊髓的表達改變情況。給SAHA 后7 天，MOR 的表達增加，HDAC2 表達降低，AH3 表達增加，n = 4（每組用3 只） 標(biāo)尺 = 100 μm *P ＜ 0.05, SAHA-CCI 組與Veh-CCI 組相比；##P ＜ 0.01, Veh-CCI 組與Veh-Sham 組相比Fig. 3 Decreased HDAC expression is associated with increased expression of MOR and enhanced analgesic effect of morphine (±SEM) (A) Compared with the Veh-Sham group, the MPAE of morphine is significantly reduced in the Veh-CCI group 3 days after surgery, n = 6 mice/group; (B, E) The expression of MOR protein increased and the level of MOR mRNA increased on the injury side of the spinal cord 7 days after intrathecal administration of SAHA; (C, F) 7 days after intrathecal administration of SAHA, the expression of HDAC2 in the spinal cord is decreased at both protein level and transcription level; (D) SAHA promote acetylation levels of histones, n = 6 (4 mice/group); (G) Immunofluorescence further confirme the expression change of each protein in the spinal cord 7 days after intrathecal injection of SAHA. 7 days after SAHA, the expression of MOR and AcH3 increased, while the expression of HDAC2 decreased, n = 4 (3 mice/group). Scale bar = 100 μm *P ＜ 0.05, group SAHA-CCI compared with group Veh-CCI; ##P ＜ 0.01, group Veh-CCI compared with group Veh-Sham.

圖4 脊髓HDAC2 下調(diào)增加損傷側(cè)脊髓中的MOR 和AcH3 表達±SEM) (A) 鞘內(nèi)注射HDAC2 siRNA 后7 天Si-CCI 組嗎啡的MPAE 明顯高于NC-CCI 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，n = 6（每組用4 只）； (B-D) Western blot 顯示鞘內(nèi)給HDAC2 siRNA7 天后，MOR 蛋白水平增加，HDAC2 蛋白水平降低，AcH3 蛋白水平增加，n = 6（每組用4 只）；(E, F) qRTPCR 顯示鞘內(nèi)給HDAC2 siRNA 7 天后，MOR mRNA 水平增加，HDAC2 mRNA 水平降低，n = 4（每組用3 只）；(G) 免疫熒光顯示在給HDAC2 siRNA 后各蛋白水平的改變，與對照組相比，給HDAC2 siRNA 后MOR 的表達增加，HDAC2 表達降低，AcH3 表達增加，n = 4（每組用3 只） 標(biāo)尺 = 100 μm *P ＜ 0.05，Si-CCI 組與NC-CCI 組相比Fig. 4 Down-regulation of spinal cord HDAC2 increases MOR and AcH3 expression in the injured side of the spinal cord (±SEM) (A) The MPAE of morphine is significantly higher in the Si-CCI group than in the NC-CCI group, 7 days after intrathecal injection of HDAC2-siRNA. n = 6 mice/group; (B-D) 7 days after intrathecal administration of HDAC2 siRNA, western blot shows the expression of MOR and AcH3 protein levels increase, while HDAC2 protein decrease. n = 6 (4 mice/group); (E, F) qRTPCR shows an increase of MOR mRNA levels and a decrease of HDAC2 mRNA levels 7 days after intrathecal administration of HDAC2 siRNA. n = 4 (3 mice/group); (G) Immunofluorescence shows the changes in the levels of each protein after HDAC2 siRNA administration, the expression of MOR and AcH3 protein levels increase, while HDAC2 protein decrease. compared with the Veh-Sham group. n = 4 (3 mice/group). Scale bar = 100 μm *P ＜ 0.05, group Si-CCI compared with group NC-CCI.

討 論

根據(jù)去乙酰化酶的初級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)，人類HDACs可分為4類共18型。I類包括HDAC1, 2, 3, 8，主要分布在細胞核內(nèi)。II類包括II a (HDAC4, 5, 7, 9)，II b (HDAC6, 10)，主要根據(jù)所受刺激在胞質(zhì)和胞核中穿梭。III 類包括SIRT1-7，是一群依賴NAD 的酶，主要分布于細胞核、細胞質(zhì)和線粒體內(nèi)。IV 類只有HDAC11，作用兼具I 和II 類[24,25]。本實驗主要研究了幾種在神經(jīng)系統(tǒng)表達豐富的亞型HDAC1, 2, 4, 5。通過Western blot 和qRTPCR 發(fā)現(xiàn)，在CCI 模型中，與對照組相比，脊髓HDAC2 穩(wěn)定且明顯的升高，神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞都有表達。同時HDAC1 也有升高的趨勢，這和之前的多項研究一致[20,26～28]。與對照組相比，MOR 的表達在術(shù)后7 天明顯的下降?？紤]到HDAC2 的表觀遺傳作用，提出HDAC2 對MOR 有調(diào)節(jié)作用。通過鞘內(nèi)注射HDACs 的泛抑制劑SAHA，以及HDAC2 siRNA 降低神經(jīng)病理性疼痛情況下升高的HDAC2，與對照組相比，MOR 的表達有所提高，且差異有統(tǒng)計學(xué)差異。通過鞘內(nèi)注射AAV5-HDAC2 過表達正常小鼠脊髓的HDAC2，HDAC2 表達增加后MOR 的表達降低。充分證實了HDAC2 對MOR 表達的調(diào)節(jié)作用，并且這種調(diào)節(jié)可能是通過MOR 基因啟動子區(qū)的組蛋白的去乙?；瘜崿F(xiàn)的。

組蛋白乙?；腿ヒ阴；巧镞^程中的兩種主要組蛋白修飾。已有多項研究表明神經(jīng)損傷上調(diào)組蛋白去乙酰化酶，導(dǎo)致組蛋白去乙?；黾硬⒁鹇蕴弁碵29,30]。組蛋白去乙?；敢种苿┛梢酝ㄟ^使神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的代謝型谷氨酸受體[31]、谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白、谷氨酸脫羧酶65[30]、腫瘤壞死因子α[32]、神經(jīng)元限制性沉默因子[2]和血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶1[33]的下調(diào)正常化來減輕疼痛。另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷導(dǎo)致組蛋白的乙酰酶的表達，促進組蛋白乙?；瘜?dǎo)致疼痛[34,35]。之前有研究表明，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以通過阻斷趨化因子和環(huán)氧合酶-2 的上調(diào)來緩解慢性疼痛[36,37]，趨化因子和環(huán)氧合酶-2 是與組蛋白乙?；T導(dǎo)疼痛的關(guān)鍵因素。本實驗在對CCI 小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷組中損傷側(cè)脊髓HDAC2的水平有明顯且穩(wěn)定的升高，組蛋白H3 的乙酰化明顯低于假手術(shù)組，正如Liang等的發(fā)現(xiàn)[19]。HDAC2 可能通過降低MOR 基因啟動子乙?；瘡亩种芃OR 的基因轉(zhuǎn)錄，降低MOR的表達。然而，在神經(jīng)病理性疼痛模型的術(shù)后7 天，組蛋白乙?；嬖谌娼档?，而應(yīng)用HDAC2 siRNA敲減脊髓HDAC2 后，組蛋白H3 的乙?；嬖龈撸f明HDAC2 調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的選擇性不強，這也限制了HDAC2 抑制劑在嗎啡鎮(zhèn)痛方面的應(yīng)用。本研究也存在一些不足之處，結(jié)果提示外周神經(jīng)損傷后脊髓HDAC2 通過降低組蛋白H3 的乙?；浇档蚆OR 在脊髓背角的表達，但并沒有檢測MOR基因啟動子區(qū)的組蛋白H3 的乙?；剑虼诉€需要進行下一步的研究來具體說明。

綜上所述，脊髓背角HDAC2 表達增加可能是導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛情況下MOR 表達降低的一個因素。但由于其會廣泛影響組蛋白H3 的乙酰化，所以HDAC 抑制劑在臨床上的應(yīng)用受到限制，需要更有針對性的藥物出現(xiàn)來輔助嗎啡在神經(jīng)病理性疼痛的治療。