鄧詩瑜 許珍珍 陳沁怡 譚朝陽 田俊杰 王 洋 馬克濤 李 麗 司軍強(qiáng) 馬新軍

（1 新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002，2 新疆昌吉州人民醫(yī)院麻醉科，昌吉 831100，3 襄陽市中心醫(yī)院麻醉科，襄陽 441000；4 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣州510120；5 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院麻醉科，危重癥醫(yī)學(xué)研究所，武漢430022）

疼痛在人群中的發(fā)病率越來越高，有關(guān)疼痛的作用機(jī)制復(fù)雜多樣，故對(duì)尋求疼痛新的作用機(jī)制的研究至關(guān)重要。瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1 (transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1) 是一種非選擇性的陽離子通道，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的感覺神經(jīng)元，尤其是與痛覺有關(guān)的無髓鞘C類纖維和部分少髓鞘的Aδ 類纖維[1]，有研究表明，在脊髓水平突觸前TRPV1 的激活會(huì)使傷害性信息的傳入增多，增加炎性疼痛的產(chǎn)生[2]，TRPV1 不僅參與疼痛的調(diào)控，TRPV1 的激活還可能誘發(fā)釋放神經(jīng)肽等，與痛覺過敏的發(fā)生密切相關(guān)[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在初級(jí)感覺神經(jīng)元中，TRPV1 被激活后可同時(shí)激活鈣激活的氯離子通道，正反饋促進(jìn)TRPV1激活引起的去極化，進(jìn)而加劇疼痛的發(fā)生[4,5]，表明Cl-參與了痛覺的調(diào)制。鈉-鉀-氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium-potassium-chloride co-transporter 1, NKCC1)是一種內(nèi)向的“Cl-泵”[6]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與KCC2 共同維持神經(jīng)細(xì)胞中的Cl-濃度的穩(wěn)態(tài)。而成年后大鼠DRG 上主要表達(dá)NKCC1，以維持細(xì)胞內(nèi)高Cl-狀態(tài)[7]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CCI 模型后NKCC1 在DRG 上的表達(dá)明顯增加[7]。另有研究顯示[8]，結(jié)腸內(nèi)注射辣椒素后，可以在相應(yīng)節(jié)段脊髓背角中發(fā)現(xiàn)NKCC1 的表達(dá)上升，以上研究結(jié)果均提示NKCC1 參與疼痛的調(diào)節(jié)，可能成為治療疼痛的靶點(diǎn)。因此，本研究主要目的是觀察在初級(jí)感覺神經(jīng)元背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)上，在大鼠足底給予辣椒素激活TRPV1 受體后，NKCC1 表達(dá)和功能的變化以及對(duì)疼痛的影響，進(jìn)而明確疼痛發(fā)生時(shí)NKCC1 可能作用及機(jī)制，為臨床治療疼痛提供理論依據(jù)與可能的治療新靶點(diǎn)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

200 只雄性SD 大鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（許可證編號(hào) SCXK New 2003-0001）。飼養(yǎng)條件為：12 h 晝夜交替，室溫20℃～25℃，濕度60%～70%，自由飲食水，通風(fēng)良好。180～250 g大鼠供實(shí)驗(yàn)使用，使用之前，先適應(yīng)周圍環(huán)境1 周。將大鼠隨機(jī)分為：正常組 (n = 24)、辣椒素組 (n = 36) 和辣椒素+布美他尼組 (n = 6)。

2.試劑、儀器

免抗NKCC1 多克隆抗體（美國，Cell Signaling 公司）；免抗p-NKCC1 多克隆抗體（美國，Merck 公司）；小鼠抗TRPV1 單克隆抗體（美國，Abcam 公司）；NKCC1 的抑制劑布美他尼（美國，Abcam 公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、TRITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、（中杉金橋），其余試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?。全自?dòng)熱幅射刺激儀(UGO BASILE 37370 Plantar Test Apparatus, Italy)；電源、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（北京，六一儀器廠）；LSM510 激光共聚焦顯微鏡（德國，Carl Zeiss 公司）；胰蛋白酶Type III、膠原酶Type IA、胰蛋白酶抑制劑、DMEM 培養(yǎng)基（美國，Sigma 公司）；Multi Clamp700B 膜片鉗放大器（美國，Axon 公司）；P-2000 微電極拉制儀（美國，Sutter 公司）；Digidata 1550A 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（美國，Axon 公司）；MP-225 微操縱儀（美國，Sutter 公司）。

3.實(shí)驗(yàn)方法

（1）模型制備：支配足底的神經(jīng)是從L3-6發(fā)出，本研究通過大鼠足底注射辣椒素構(gòu)建急性神經(jīng)源性炎癥模型[9]，觀察L3-6神經(jīng)節(jié)蛋白的變化情況。在4%七氟醚麻醉下，大鼠左側(cè)足底皮下注射辣椒素(3 mg/ml)（APExBIO，A3278，美國）模擬急性神經(jīng)源性疼痛，即刻可以觀察到大鼠大腿回縮，使針尖停留于皮下數(shù)秒，待藥物吸收完全后拔出針頭，此時(shí)可見大鼠大腿回蹬、甩足。待大鼠數(shù)秒清醒過后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

參照Pogatzki 等[10]的方法, 在正常大鼠身上行鞘內(nèi)置管術(shù)。將大鼠麻醉后俯臥固定、備皮、在L5-6上方做縱切口，依次分離組織，用PE-10 導(dǎo)管穿過椎間隙，若看到尾部或者后肢抽動(dòng)，同時(shí)有清亮的腦脊液流出，則固定導(dǎo)管，經(jīng)皮下隧道于頸部傳出，外露2 cm 左右固定，待大鼠清醒，通過導(dǎo)管注射2%利多卡因10 μl，若在注射后30 s 內(nèi)出現(xiàn)雙下肢癱瘓并于30 min 內(nèi)恢復(fù)，則判斷置管成功。

（2）痛行為學(xué)測(cè)試：各組分別在術(shù)前1 h、術(shù)后10 min、30 min、60 min、120 min 隨機(jī)抽取6 只大鼠進(jìn)行熱痛閾值和冷痛閾值測(cè)定。熱痛閾值依據(jù)Hargreaves 等[11]的方法進(jìn)行操作。在安靜環(huán)境中，將大鼠單獨(dú)放入底部透明的有機(jī)玻璃箱內(nèi)提前適應(yīng)周圍環(huán)境10～15 min 后，用熱輻射刺激儀熱源垂直照射注射辣椒素側(cè)的皮膚，記錄從照射開始至大鼠抬足時(shí)間，最長時(shí)間為30 s，測(cè)定時(shí)保持刺激強(qiáng)度相同。每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3 次，每次至少間隔5 min，取3 次平均值為熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)[12]。TWL 值越低，表示大鼠對(duì)熱刺激的痛覺過敏越嚴(yán)重。

冷痛閾值根據(jù)Norcini 等[13]的方法，將大鼠放置在自備網(wǎng)籠內(nèi)，待其安靜后，將0.1 ml 丙酮滴到大鼠注射辣椒素的左后足底皮膚上，并同時(shí)計(jì)時(shí)。記錄大鼠抬足至將足放下的時(shí)間，即為大鼠的冷刺激抬足時(shí)間。每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3 次，每次至少間隔5 min，取3 次平均值為冷縮足反射潛伏期(cold withdrawal latency, CWL)。CWL 值越高，表示大鼠對(duì)冷刺激的痛覺過敏越嚴(yán)重。

（3）免疫熒光：腹膜內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉深度麻醉大鼠，暴露心臟，用針尖從心尖稍偏左的位置刺穿左心室壁進(jìn)入升主動(dòng)脈，將右心耳剪破。用生理鹽水灌流至流出的液體澄清，之后換用4%的多聚甲醛繼續(xù)進(jìn)行灌流，觀察到大鼠四肢及頭頸部僵硬為止。隨后沿棘突依次剪開椎管，暴露脊髓，在顯微鏡下迅速剝離背根神經(jīng)節(jié)。將修剪好的DRG置于4%多聚甲醛中后固定12 h，脫水后石蠟包埋，制作石蠟切片(5 μm)。石蠟切片進(jìn)行常規(guī)的脫蠟，用枸櫞酸進(jìn)行抗原修復(fù)，破膜，5% BSA 封閉1 h，一抗4℃過夜孵育：共同孵育小鼠抗TRPV1 (1:50)和兔抗NKCC1 (1:100)，單獨(dú)孵育兔抗p-NKCC1 (1:100)。復(fù)溫，PBS 清洗3 次，37℃避光孵育對(duì)應(yīng)的二抗1 h：TRITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG，再用PBS 清洗3 次，滴加抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片，共聚焦顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并攝取圖片。選用Image-J 圖像分析軟件進(jìn)行陽性細(xì)胞面積率的統(tǒng)計(jì)。

（4）Western blotting：大鼠麻醉后處死，取L4-6節(jié)段脊柱，置于人工腦脊液(aCSF):1.3 mmol CaCl2·2H2O, 2.6 mmol KCl, 0.9 mmol MgCl2, 21 mmol NaHCO3, 2.5 mmol Na2HPO4·7H2O, 125 mmol NaCl, 3.5 mmol 葡萄糖，pH 7.2～7.4 中，在顯微鏡下分離術(shù)側(cè)DRG，剪碎后加入裂解液，提取總蛋白，用BCA 法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，100℃，10 min 使蛋白變性，取一定量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至0.45 nm PVDF 膜上后，5%脫脂牛奶封閉2 h。一抗4℃搖床過夜孵育。TBST 洗膜3 次，用二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，孵育2 h，再次用TBST 洗膜3 次，加入新鮮配制ECL 熒光顯色。采用Image-J 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

（5）急性分離DRG 神經(jīng)元：參考本實(shí)驗(yàn)室前期采用的方法[14]，大鼠麻醉后處死后，取L4-6節(jié)段脊柱，放入盛有氧飽和的細(xì)胞外液中(NaCl 150 mmol/L,KCl 5 mmol/L, MgCl21 mmol/L, HEPES 10 mmol/L, D-glucose 10 mmol/L, Sucrose 20 mmol/L, CaCl23.32 mmol/L,pH 為7.2～7.4，滲透壓為320～350 mOsm)。用精細(xì)角膜剪和游絲鑷分離修剪DRG，將DRG 充分剪碎，用消化酶（胰蛋白酶Type III 0.24 mg/ml 和膠原酶TypeIA 0.6 mg/ml，溶劑為DMEM 培養(yǎng)基）在37℃水浴鍋中消化3～4 min。消化結(jié)束后立即加入少量胰蛋白酶抑制劑終止消化。靜置待細(xì)胞貼壁，待細(xì)胞貼壁充分后，加入氧飽和的細(xì)胞外液。

（6）膜片鉗：鏡下選取膜表面光滑、透亮、狀態(tài)良好的直徑在30～50 μm 的DRG 細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象[15]。選取電阻值為2～8 MΩ 的微電極，充灌電極內(nèi)液(K-Gluconate 130 mmol/L, NaCl 10 mmol/L, MgCl2·6 H2O 1.2 mmol/L, CaCl22 mmol/L, EGTA 5 mmol/L, HEPES 10 mmol/L, D-Glucose 7.5 mmol/L, pH值為7.2～7.4，滲透壓為320～350 mOsm)，將充灌好細(xì)胞內(nèi)液的玻璃微電極連接在微操縱儀上。操作微操縱儀，電極尖端接觸細(xì)胞，接觸細(xì)胞的瞬間可以從膜測(cè)試窗口觀察到電極電阻略微升高。用嘴吸法給予微電極內(nèi)部一定負(fù)壓，同時(shí)將鉗制電位逐步調(diào)節(jié)至-60 mV，待細(xì)胞與電極間形成GΩ 封接后，用嘴吸破膜法或同時(shí)輔助以電擊破膜法破膜。破膜后，阻值仍維持在GΩ 以上的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。在顯微鏡下記錄細(xì)胞直徑。所用藥物：γ 氨基丁酸(γ-amino-butylic acid, GABA)(10-4M)、辣椒素(10 μM)，以上藥物用排藥管給藥，給藥管口距離所記錄細(xì)胞100 μm。記錄的信號(hào)經(jīng)Multi Clamp 700B 膜片鉗放大器放大，給予10 kHz 的濾波后，由AxonDigidata 1550A 數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換，采樣頻率為10～20 kHz。

（7）氯離子熒光探針(MQAE)：足底給予辣椒素60 min 后，急性分離各組大鼠DRG，用眼科剪剪碎、消化、離心、棄上清，加入96 孔板中，抑制劑組孵育布美他尼(10 μM) 30 min，吸出后再加入含有布美他尼的MQAE 緩沖液，37℃孵育30 min，緩沖液清洗，熒光顯微鏡拍照。當(dāng)氯離子濃度升高時(shí)，MQAE 的熒光強(qiáng)度隨著氯離子濃度的增加而降低。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1. TRPV1 和NKCC1 在DRG 上的分布

DRG 可以根據(jù)細(xì)胞直徑分為小細(xì)胞(＜ 25 μm)，中細(xì)胞（25 μm ≤直徑＜ 40 μm），大細(xì)胞(≥40 μm)。以往的研究證實(shí)在DRG 神經(jīng)元細(xì)胞中，傳遞傷害性感受信號(hào)主要是無髓鞘的C 類纖維和有髓鞘的Aδ 纖維，而絕大多數(shù)都是中小型細(xì)胞[15]。免疫熒光結(jié)果顯示，在正常大鼠DRG 神經(jīng)元上可觀察到TRPV1 主要在中小型細(xì)胞上表達(dá)，而NKCC1 不僅在大細(xì)胞的膜上有表達(dá)，在中小型神經(jīng)元細(xì)胞上也有表達(dá)，并且觀察到TRPV1 和NKCC1 在中小型神經(jīng)元細(xì)胞存在共表達(dá)（見圖1）。

2.足底注射辣椒素后大鼠疼痛行為學(xué)改變

足底注射辣椒素后，發(fā)現(xiàn)大鼠TWL 降低，而CWL 明顯延長，60 min 左右可見大鼠抬足、舔足時(shí)間明顯增加；而鞘內(nèi)給予NKCC1 抑制劑布美他尼(5 μg/μl)后給予辣椒素，大鼠TWL 和CWL 均有所恢復(fù)（見圖2）。

3.給予辣椒素后DRG 上NKCC1 及p-NKCC1的蛋白分布及其變化

免疫熒光結(jié)果顯示（見圖3），辣椒素組NKCC1 在中小細(xì)胞的核膜上表達(dá)明顯增多，而p-NKCC1 在中小細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)增多。Western blotting 結(jié)果顯示（見圖4），辣椒素組DRG上NKCC1和p-NKCC1 的蛋白表達(dá)量均增加，在60 min 時(shí)表達(dá)量最高，蛋白變化與行為學(xué)變化一致。

4. GABA 的激活電流

圖1 免疫熒光顯示正常組TRPV1 和NKCC1 表達(dá)分布情況 標(biāo)尺 = 50 μmFig. 1 Immunofluorescence showing distribution of TRPV1 and NKCC1 in the DRG Scale bar = 50 μm

圖2 足底注射辣椒素后疼痛行為學(xué)變化 (n = 6, ±SD) ***P ＜ 0.001，&&&P ＜ 0.001，與正常組相比；###P ＜ 0.001， $$$P ＜ 0.001，與辣椒素組相比Fig. 2 The change of pain behavior after plantar injection of capsaicin (n = 6, ±SD) ***P ＜ 0.001, &&&P ＜ 0.001, compared with the control group; ###P ＜ 0.001, $$$P ＜ 0.001, compared with the capsaicin group.

選取直徑大小為30～50 μm DRG 細(xì)胞，排藥管給予辣椒素(10 μM)后檢測(cè)的GABA 激活電流相比正常組明顯增加；在給辣椒素之前孵育布 美 他 尼(10 μM)15 min，GABA 的 激 活 電 流 減小。各組的GABA 激活電流大小依次為：正常組(151.93±18.50) pA、辣椒素組(540.77±45.91) pA、布美他尼組(211.43±24.36) pA（見圖5）。

5.給辣椒素后大鼠DRG 神經(jīng)元中氯離子濃度的變化

氯離子熒光探針結(jié)果顯示：辣椒素組DRG 神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度比正常組明顯增高，布美他尼組氯離子濃度有所降低（見圖6）。

討 論

有關(guān)疼痛的機(jī)制復(fù)雜多樣，其中離子通道的改變是形成異常放電、引起疼痛的主要原因之一。本研究的痛行為學(xué)結(jié)果顯示辣椒素組TWL 降低、CWL 延長，而給予布美他尼預(yù)處理后TWL 升高、CWL 縮短；免疫熒光和western blotting 顯示在正常大鼠DRG 神經(jīng)元上TRPV1 和NKCC1 在與疼痛相關(guān)的中、小DRG 神經(jīng)元上共表達(dá)，激活TRPV1 后NKCC1 在核膜上的表達(dá)增多，而p-NKCC1 在胞質(zhì)中或胞膜上表達(dá)明顯增加；熒光探針結(jié)果顯示辣椒素組DRG 神經(jīng)元內(nèi)Cl-濃度明顯增加，給予布美他尼預(yù)處理后Cl-濃度降低，這些結(jié)果均提示TRPV1的激活可以引起NKCC1 的改變，并加重實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的疼痛。

圖5 膜片鉗記錄(A)正常組；(B)辣椒素組；(C)辣椒素+布美他尼組的GABA 激活電流大小(n = 6)Fig. 5 Patch clamp recording of GABA currents (n = 6) in the control group (A); the capsaicin group (B); the bumetanide group (C).

圖6 氯離子熒光探針顯示(A)正常組、辣椒素組和辣椒素+布美他尼組，大鼠DRG 中細(xì)胞內(nèi)氯離子的濃度變化(n = 3) 標(biāo)尺 = 100 μm；(B)各組熒光密度的比較 **P ＜ 0.01，與正常組相比；#P ＜ 0.05，與辣椒素組相比Fig. 6 Chloride ion fluorescent probe shows (A) changes in intracellular chloride ion concentration in DRG of control group, capsaicin group, and bumetanide group (n = 3). Scale bar = 100 μm; (B) statistical diagram of fluorescence density of each group. **P ＜ 0.01, compared with the control group; #P ＜ 0.05, compared with the capsaicin group.

有研究顯示，在正常大鼠DRG 神經(jīng)元上NKCC1 mRNA 與TRPV1 在中、小型神經(jīng)元上存在共表達(dá)[16]。Galan 等[17]在小鼠腹部結(jié)腸內(nèi)給予辣椒素10 min 后，發(fā)現(xiàn)脊髓背角快速短暫的p-NKCC1 變化，并且給予布美他尼后，可以阻斷辣椒素引起的疼痛。Mòdol 等[18]發(fā)現(xiàn)在坐骨神經(jīng)損傷2 周后，給予布美他尼可以防止痛覺過敏的出現(xiàn)。另有研究顯示[19]，高滲環(huán)境中會(huì)激活晶狀體上TRPV1 通道，使大量的Ca2+內(nèi)流，激活ERK/OSR1 等激酶，進(jìn)而使NKCC1活化。也有研究發(fā)現(xiàn)[20]，辣椒素能引起小鼠脊髓內(nèi)Ca2+/CaMKII 的快速激活，使NKCC1 發(fā)生磷酸化。但是有關(guān)初級(jí)感覺神經(jīng)元上NKCC1 的活化是否可以在功能上增強(qiáng)TRPV1 引起的疼痛，目前還不明了。

本研究結(jié)果顯示，大鼠足底給予辣椒素激活TRPV1 后，可能通過非選擇性的陽離子通道促使Ca2+內(nèi)流，也可能通過激活神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的Ca2+/ CaMKII 或相應(yīng)的激酶，使NKCC1 和p-NKCC1 的蛋白表達(dá)增加，同時(shí)使NKCC1 通道蛋白活化。本研究結(jié)果還表明，辣椒素組NKCC1 在DRG 神經(jīng)元的核膜上表達(dá)增加明顯，而p-NKCC1 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上的表達(dá)增加明顯，這可能與TRPV1 激活后NKCC1 的轉(zhuǎn)錄和翻譯增強(qiáng)，新合成NKCC1 增加，同時(shí)使磷酸化后的p-NKCC1 由核膜轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜發(fā)揮生理功能有關(guān)。

不僅如此，本研究電生理結(jié)果顯示，辣椒素組DRG 神經(jīng)元GABA 激活電流明顯增加，同時(shí)氯離子熒光探針結(jié)果也顯示，辣椒素組DRG 神經(jīng)元內(nèi)氯離子濃度明顯增高，但預(yù)處理布美他尼均能逆轉(zhuǎn)辣椒素激活TRPV1 后的作用，提示辣椒素激活TRPV1 后，NKCC1 不僅表達(dá)量增加，而且轉(zhuǎn)運(yùn)Cl-的能力也明顯增強(qiáng)，使DRG 神經(jīng)元內(nèi)保持較高水平的Cl-濃度。DRG 神經(jīng)元內(nèi)的Cl-濃度升高如何引起辣椒素激活TRPV1 后的疼痛加?。客茰y(cè)可能有兩方面的原因：第一，在初級(jí)感覺傳入的外周端，由于TRPV1 和鈣激活氯離子通道相互作用[4,5]，當(dāng)DRG 神經(jīng)元中Cl-濃度提高時(shí)，TRPV1 激活后引起的鈣激活氯離子通道開放，Cl-外流介導(dǎo)的去極化正反饋?zhàn)饔眉訌?qiáng)，因而使外周痛覺感受器部位更容易爆發(fā)動(dòng)作電位，產(chǎn)生疼痛。第二，在初級(jí)感覺傳入的中樞端，初級(jí)傳入的興奮到脊髓背角激活抑制性中間神經(jīng)元，其末梢釋放GABA，正常時(shí)GABA能神經(jīng)元作為中間抑制性神經(jīng)元參與初級(jí)感覺傳遞的調(diào)節(jié)，可通過GABA 能神經(jīng)纖維與初級(jí)感覺末梢中樞端形成的突觸，降低初級(jí)感覺末梢中樞端突觸前膜的膜電位，產(chǎn)生初級(jí)傳入去極化，使突觸前膜Ca2+內(nèi)流減少，驅(qū)動(dòng)突觸小體融合成突觸囊泡釋放的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)減少，發(fā)生突觸前抑制，產(chǎn)生抑制疼痛作用。但是當(dāng)TRPV1 激活后，DRG 神經(jīng)元內(nèi)由于NKCC1 的活動(dòng)增加使Cl-濃度大大提升，此時(shí)中間抑制性神經(jīng)元激活釋放的GABA 作用于GABAA受體，開放Cl-通道，Cl-外流增加（內(nèi)向電流加大，見圖5），使初級(jí)感覺末梢中樞端突觸前膜的膜電位發(fā)生急劇的、過度的去極化而達(dá)到閾電位引發(fā)動(dòng)作電位，可直至引起背根反射(dorsal root reflex, DRR)，產(chǎn)生痛敏[21]引起疼痛。

綜上所述，通過足底注射辣椒素激活TRPV1，能使NKCC1和p-NKCC1的蛋白及其功能發(fā)生改變。因此，認(rèn)為TRPV1 激活后不僅只激活了非選擇性的陽離子通道引起疼痛，而且可以活化NKCC1，使通道開放，提高DRG 神經(jīng)元胞體中的Cl-（陰離子）濃度，正反饋地加強(qiáng)了TRPV1 引起的疼痛，表明TRPV1 和NKCC1 兩者共同對(duì)疼痛產(chǎn)生調(diào)節(jié)。但TRPV1 激活后對(duì)NKCC1 調(diào)節(jié)的中間機(jī)制還不清楚，仍需要去進(jìn)一步的探討。