王 丹，張紅星△，榮培晶，侯理偉，李少源，王 瑜，王俊英，張金鈴，趙 斌，國 笑，張 悅，張紫璇，王藝霏，何家愷

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430061； 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)屬于功能性胃腸病范疇，主要表現(xiàn)為上腹痛或灼燒，餐后早飽、腹脹等，且并無引起這些癥狀的具體疾病，消化系統(tǒng)也無任何器質(zhì)性病變[1-2]。目前，F(xiàn)D的發(fā)病機(jī)制尚處于探索階段，主要認(rèn)為可能與腦腸軸、腦腸肽、HP(Helicobacter Pylori，幽門螺桿菌)感染、胃腸動(dòng)力障礙、內(nèi)臟高敏感性、腸道菌群失調(diào)、心理及精神因素、輕度炎癥等相關(guān)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)[4]，十二指腸的輕度炎癥能引起局部感覺、運(yùn)動(dòng)障礙，從而導(dǎo)致腹脹、腹痛。Toll樣受體(TLRs)和NF-κB (Nuclear factor κB，核轉(zhuǎn)錄因子κB)可激發(fā)細(xì)胞信號(hào)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)[5-6]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)了10余種TLRs模式識(shí)別受體,其中TLR4在炎癥組織中表達(dá)最多，如潰瘍性結(jié)腸炎。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[7]，當(dāng)抑制NF-κB p65表達(dá)時(shí)，可顯著降低炎癥因子水平，因此NF-κB p65在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)十二指腸TLR4(Toll-like receptors 4,Toll樣受體4)、NF-κB p65表達(dá)情況及血清IL-6(Interleukin 6，白介素-6)、TNF-α(Tumor Necrosis Factor α，腫瘤壞死因子α)水平，探究電針治療FD的新靶點(diǎn)及FD的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，購自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(鄂)2017-0012。經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)許可飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房，室溫22 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，每籠5只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始試驗(yàn)。喂養(yǎng)期間自由飲水、攝食。本實(shí)驗(yàn)已通過湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 主要試劑與儀器

TLR4抗體(Santa Cruz公司，批號(hào)Sc-293072)，NF-κB p65抗體(武漢三鷹，批號(hào)10745-1-ap)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)；兔多抗(杭州賢至，批號(hào)AB-P-R 001)；HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗(武漢博士德，BA1051)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德，BA1054)；水合氯醛(上海國藥集團(tuán)公司，批號(hào)40935760)。

華佗牌0.35×25 mm(1寸)無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);HANS-200 A型韓式穴位神經(jīng)刺激儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司); 垂直電泳槽(北京六一儀器廠，型號(hào)：DYCZ-24DN)；電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠，型號(hào)：DYCZ-40)；離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)：HI650)；酶標(biāo)儀(Thermo，型號(hào)：mμLISKANMK3)；自制大鼠鼠衣及懸掛大鼠裝置。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模

將30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、電針組各10只。模型組及電針組大鼠參考多因素干預(yù)法[8]加以適當(dāng)改良制備FD肝郁脾虛模型。冰生理鹽水灌胃：配制0.9% NaCl溶液，置于冰箱中冰凍至-4 ℃，每次灌胃2 mL，每日1次；夾尾法刺激：用長尾夾包裹紗布以免損傷大鼠尾部，夾在大鼠尾部后2/3處，以不破皮為度, 令其暴怒并激怒全籠大鼠，表現(xiàn)為大鼠均站立，雙上肢打斗，每天1次(刺激間隔不少于6 h)，每次30 min，隔日禁食，飲水正常。以上三法按順序同時(shí)實(shí)施，造模20 d。每日21時(shí)稱大鼠體質(zhì)量并登記，記錄所有大鼠每日食物等質(zhì)量。

造模成功標(biāo)志：大鼠體質(zhì)量進(jìn)行性減輕；活躍程度從時(shí)?；\中自發(fā)打斗至喜成堆蜷縮，敲打籠子仍不動(dòng)彈，抓捕反應(yīng)遲鈍；情緒由稍有聲響就易怒煩躁轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)噪音刺激或是喂食仍無特別反應(yīng)，情緒異常低落；鼠毛從白凈順滑至凌亂、倒張、發(fā)黃，大鼠糞便從深棕色、干燥、質(zhì)硬、無臭、長條圓柱狀進(jìn)展成棕黃色、濕潤、質(zhì)軟、微臭、短條圓柱狀，最后成為黃綠色稀便，可見未消化的顆粒飼料奇臭。經(jīng)模型評(píng)價(jià)，模型組及電針組20只大鼠造模均成功，在造模期間空白組大鼠給予安靜環(huán)境隔離，不予任何處置。

1.4 電針刺激

造模結(jié)束后第2天開始對(duì)電針組進(jìn)行電針干預(yù)。給電針組大鼠穿上定制的鼠衣后懸掛于自制懸掛架上。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]選取“足三里”穴，即大鼠的“后三里”穴。再選取“太沖”穴酒精局部消毒后，采用0.35×25 mm(1寸)針灸針分別直刺深度約12.5 mm(約0.5寸)、5 mm(約0.2寸)。將雙側(cè)“后三里”穴接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀連續(xù)波，頻率2 Hz，強(qiáng)度1 mA，雙側(cè)“太沖”穴靜留針，每次治療時(shí)間30 min，每日治療1次(9AM～11AM)，治療14 d?？瞻捉M和模型組在治療期間給予電針組同樣的穿鼠衣及懸吊，不予其他任何處置，在安靜環(huán)境中隔離。在電針組最后1次治療結(jié)束，將各組大鼠稱重并禁食24 h后取材。

1.5 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酶聯(lián)免疫吸附劑檢測(cè))測(cè)定血清IL-6、TNF-α水平

治療結(jié)束后各組大鼠均禁食24 h后取材，用20%烏拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉后,給予腹主動(dòng)脈采血，3000 r/min離心15 min,取上清液后置于干凈EP管。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書，按步驟檢測(cè)大鼠血清IL-6、TNF-α水平，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6 WB(Western blot，免疫印跡法)檢測(cè)十二指腸TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)

取少量十二指腸碎組織加入0.3 mL裂解液勻漿后裂解，隨后于4 ℃下12000 r/min離心5 min，取上清液，提取總蛋白之后用DG-3022 A酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度。隨后將提取的蛋白上清與5ⅹ蛋白上樣緩沖液進(jìn)行沸水浴中10 min，使蛋白變性。配置5%濃縮膠、12%分離膠后開始電泳、轉(zhuǎn)模、免疫印跡顯色等步驟檢測(cè)后得到灰度條帶，用Image J軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較

表1示，與空白對(duì)照組比較, 模型組及電針組大鼠血清IL-6均升高,模型組TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，但電針組TNF-α水平較空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與模型組比較, 電針組大鼠血清IL-6、TNF-α均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示電針能明顯降低肝郁脾虛FD模型大鼠血清IL-6、TNF-α的含量。

表1 各組大鼠IL-6、TNF-α水平比較

2．2 各組大鼠十二指腸TLR4、NF-κB p65表達(dá)比較

圖1示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠十二指腸TLR4、NF-κB p65表達(dá)顯著增多(P<0.05)。與模型組比較，電針組大鼠十二指腸TLR4、NF-κB p65表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

注：與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05圖1

3 討論

FD雖然并不是致命的急性疾病，但其極度影響患者的生活質(zhì)量，加重社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)。據(jù)調(diào)查[10]，在全世界范圍內(nèi)，20%的人群受FD困擾。因此，F(xiàn)D的病因病機(jī)研究一直是熱點(diǎn)。羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)提出，低度炎癥、腸道菌群改變等可能與FD發(fā)病有關(guān)[10]。研究表明，功能性胃腸病患者均存在低度黏膜炎癥和免疫細(xì)胞活化，且與腸黏膜屏障損傷及腸神經(jīng)異常敏感有關(guān)[11-12]。

TLRs位于細(xì)胞膜上，是一種模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)。TLRs能激活免疫應(yīng)答，是防御外來毒物的第一層屏障，也是目前應(yīng)用于抗炎癥治療的重要靶點(diǎn)[13-14]。研究表明，TLRs可通過激活下游信號(hào)通路產(chǎn)生大量炎癥因子，誘導(dǎo)疾病的發(fā)生[15]。大鼠胃腸黏膜上存在TLR4，正常狀態(tài)下TLR4表達(dá)量極少，當(dāng)機(jī)體處于炎癥狀態(tài)時(shí)，TLR4表達(dá)增多。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4激活可使樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞相繼活化，分泌大量促炎細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α等，導(dǎo)致組織炎癥損傷[16]。NF-κB是一種重要的參與炎癥介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子，p65 是NF-κB的5個(gè)亞單位之一。在靜息狀態(tài)下與抑制性蛋白(Inhibitor kappaB, IκB)結(jié)合，存在于細(xì)胞質(zhì)中；當(dāng)受到內(nèi)源性或外源性刺激，NF-κB中脫離IκB入核與DNA結(jié)合，參與相應(yīng)蛋白合成，調(diào)控炎癥免疫反應(yīng)。NF-κB的下游促炎因子如TNF-α和IL-6，可在其被激活后迅速增多并加劇炎癥反應(yīng)[17]。因此，NF-κB p65可反映炎癥嚴(yán)重程度，也可用來評(píng)價(jià)療效[18]。

中醫(yī)并無FD命名，根據(jù)該病的相關(guān)癥狀，其屬于“痞滿”“胃脘痛”范疇。中醫(yī)療法治療FD療效顯著，已經(jīng)越來越受廣大醫(yī)生及患者的認(rèn)可，如電針、穴位敷貼、耳穴貼壓、拔罐等[19]。臨床研究表明[20]，電針治療FD患者后可顯著緩解上腹痛、早飽等不適。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，電針可改善FD大鼠稀便、毛發(fā)干枯凌亂[21]、增強(qiáng)胃腸動(dòng)力[22-23]、減輕局部炎癥及免疫反應(yīng)[24]等，因此電針治療FD療效肯定。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫鬄楦斡羝⑻撟C，選取太沖穴可疏理肝氣，調(diào)暢氣機(jī)；足三里穴可補(bǔ)中氣、調(diào)理氣機(jī)、幫助運(yùn)化, 疏通胃腸，兩穴合用共奏補(bǔ)虛瀉實(shí)、疏肝健脾之功。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，電針治療后大鼠十二指腸TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低，且IL-6、TNF-α也較模型組降低。提示電針減輕FD大鼠炎癥反應(yīng)，可能通過降低TLR4、NF-κB p65表達(dá)實(shí)現(xiàn)。因此，本研究結(jié)果驗(yàn)證了FD病因可能與消化道低度炎癥有關(guān)，而TLR4、NF-κB p65二者之間可能存在某種關(guān)系，減輕炎癥因子(IL-6, TNF-α)的合成，但二者之間的信號(hào)溝通關(guān)系需要進(jìn)一步研究。