李美丹，姚 蘭，梁群卿，黃李冰雪，鐘 嬋，郭華慧，王 瑋，劉雪頻，黃仁發(fā)

(1. 廣西中醫(yī)藥大學研究生學院，南寧 530001； 2. 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院健康體檢中心，南寧 530011； 3. 廣州中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院腎內科，廣東 深圳 518034)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)指各種原因引起腎功能在短時間內迅速惡化，導致水電解質、酸堿平衡紊亂和含氮產物聚積的一組綜合征[1]。流行病學顯示，全球每年約1330萬住院患者發(fā)生AKI，約170萬死于AKI及其并發(fā)癥；中國危重癥患者AKI發(fā)生率達30.0%～50.0%，死亡率為16.7%[2]。臨床上主要從保護腎單位、糾正酸堿平衡及電解質紊亂等方面治療AKI，目前尚缺乏特效藥[3]。近年來，急性腎損傷藥物治療的相關研究成為醫(yī)學界的熱點。防己茯苓湯源自張仲景《金匱要略》：“皮水為病，四肢腫，水氣在皮膚中，四肢聶聶動者，防己茯苓湯主之。[4]”全方由防己、茯苓、黃芪、桂枝、甘草5味藥組成，具有利水消腫、通陽益氣之功，是脾虛水腫證的基礎方。研究表明，防己茯苓湯通過抑制腫瘤壞死因子誘導后系膜細胞的增殖及增加基質金屬蛋白酶-2(matrix meta-lloproteinase-2，MMP-2)的表達來治療AKI[5]。但防己茯苓湯的具體作用機制及相關通路如何目前尚未明確。網絡藥理學作為一種新興的研究理念和方法，通過融合多學科的技術和內容，從整體角度構建疾病-藥物-靶點網絡，探究疾病與藥物間的關聯性，其研究方法與中醫(yī)整體觀念不謀而合[6-7]。因此，本文以防己茯苓湯為研究對象，通過網絡藥理學方法構建藥物活性成分-靶點網絡，進一步探究對AKI治療的作用機制，為臨床應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 防己茯苓湯的化學成分

本研究依據網絡藥理學分析技術平臺(TCMSP) (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以防己、茯苓、黃芪、桂枝、甘草5味中藥為檢索詞，檢索防己茯苓湯中藥物組成的所有化學成分。

1.2 藥物的活性化合物及靶點的篩選

口服生物利用度(oral bioavailability，OB)是藥物代謝動力學最重要的參數之一，其涉及藥物的吸收、分布、代謝和排泄，其表示口服藥物經胃腸道消化吸收，經過肝臟最后到達體循環(huán)血液中的藥量占口服劑量的百分比[8]。類藥性(drug likeness，DL)指化合物與已知藥物的相似性。本研究借助TCMSP數據庫，篩選出防己、茯苓、黃芪、桂枝、甘草所有化學成分中符合OB≥30%和DL≥0.18的活性化合物。利用Pub Chem(https: // pubchem．ncbi．nlm．nih．gov /) 獲得各化合物SMILES,將各化合物SMILES 導入Swiss Target Prediction 數據庫(http: //www．Swiss target prediction．ch /)獲取化合物所對應的靶點。

1.3 化合物-靶點網絡的構建

使用Excel將防己茯苓湯的化合物和靶點構建成化合物-靶點對應關系，經去重后將Excel文件導入Cytoscape 3.7.1軟件構建可視化的化合物靶點圖，以探究防己茯苓湯的藥理學作用機制，并進行網絡拓撲學結構分析。

1.4 AKI疾病靶點的篩選

通過在CTD(http: // ctd. mdibl. org /)數據庫中輸入關鍵詞“acute kidney injury”，搜索AKI的疾病靶點，經整合、處理、去除假陽性基因后選取推論分數較高的靶點并保存。

1.5 活性化合物靶點與AKI疾病靶點的Venn分析

將防己茯苓湯藥物中經去重后的活性化合物靶點與CTD數據庫篩選出的AKI疾病靶點進行維恩(Venn)分析，得到共同的靶點集并形成可視化的Venn圖，以顯示中藥復方活性成分與AKI的靶向關系。

1.6 構建蛋白相互作用網絡(PPI)

為更好地闡明防己茯苓湯治療AKI靶點蛋白在系統水平上的相互作用，將“1.5”項得到的共同靶點集導入在線STRING(https://string-db.org/)數據庫，將蛋白來源設置為“Homo sapiens”(人類)進行操作，并選取評分條件大于0.90的高置信度數據，以隱藏圖中孤立的蛋白，最終導出可視化的PPI網絡圖。

1.7 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析與KEGG通路富集分析

為進一步探究防己茯苓湯治療AKI靶點集在基因功能和信號通路中的作用，本研究利用DAVID 6.8數據庫(https: //david. ncifcrf. gov /)對“1.5”項得到的靶點集進行GO功能富集分析與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。將“1.5”項獲得的靶點集復制到DAVID平臺的通用管理板中，將“Select Identifier”設定為“Official Gene Symbol”，“List Type”設定為“Gene List”，同時將平臺中的“List與Background”都設定為“Homo Sapiens”提交列表得出GO功能富集分析與KEGG通路富集分析結果。對GO結果繪制可視化的條形圖，通過Omicshare 平臺制作KEGG通路氣泡圖。

2 結果

2.1 防己茯苓湯活性化合物及靶點的篩選

表1示，基于數據庫構建方法，從TCMSP數據庫中檢索防己茯苓湯全方防己、茯苓、桂枝、黃芪、甘草所有化學成分，共獲得671種活性化合物，其中防己50種，茯苓34種，桂枝220種，黃芪87種，甘草280種。以OB≥30%和DL≥0.18的條件進行篩選，最終得到候選活性化合物共137種，其中防己3種，茯苓15種，桂枝7種，黃芪20種，甘草92種。將候選化合物去重后得到127種。經Swiss Target Prediction數據庫可獲得所有化合物所對應的靶點共2041個，去重后可得273個靶點。

表1 防己茯苓湯127種化合物信息比較

2.2 防己茯苓湯活性化合物-靶點相互作用網絡

圖1示，利用127種化合物與273個靶點的關系，將數據導入Cytoscape 3.7.1軟件，繪制防己茯苓湯活性化合物-靶點相互作用網絡圖。在化合物-靶點網絡圖中，防己茯苓湯活性化合物分子用中間所示的矩形節(jié)點代表，靶點蛋白用外周兩圈的節(jié)點表示，邊表示化合物分子與靶點蛋白相互作用關系，共400個節(jié)點(127個化合物分子節(jié)點與273個靶點蛋白節(jié)點)和2041條邊。在網絡中，一個節(jié)點的度值(Degree)表示連接該節(jié)點路線的數量，數量越多節(jié)點越大，即度值與節(jié)點的大小呈正相關。中介中心性表示網絡中某節(jié)點連接2個節(jié)點之間最短路徑的次數，次數越多表示該節(jié)點在網絡中越關鍵。該網絡拓撲學結果顯示，節(jié)點平均Degree值為10.205，共有192個節(jié)點大于平均Degree值；節(jié)點平均中介中心性為0.00595279，共有102個節(jié)點大于平均中介中心性。根據網絡中Degree值、中介中心性及平均中介中心性所得結果，篩選出Degree值較大、中介中心性高的核心節(jié)點進行分析，這些連接較多化合物或靶點的節(jié)點在整個網絡中起到紐帶作用，可能是重要的化合物或靶點。在該網絡中，每個化合物平均對應17個靶點，每個靶點平均與8個化合物相互作用，因此防己茯苓湯中存在一個化合物與多個靶點之間的相互作用，同時也存在不同化合物協同作用于同一個靶點的現象，這體現了中藥多成分與多靶點之間相互作用的機制，符合中藥復方的機理。通過對化合物分析，作用靶點≥15個的化合物占88%，其中有10個化合物的作用靶點≥26個；Degree值排名前3位的化合物分別為β-谷甾醇(MOL000358)、常春藤皂苷元(MOL000296)、谷甾醇(MOL000359)，都與30個靶點蛋白發(fā)生相互作用。從靶點的角度，Degree值排名前3位的靶點為MAPT、TDP1、PTPN2，分別與97、76、53個化合物發(fā)生相互作用。

注：中間矩形節(jié)點代表化合物，外圍兩圈節(jié)點代表靶點，節(jié)點的大小與節(jié)點的度呈正相關圖1 防己茯苓湯化合物-靶點網絡

2.3 篩選AKI疾病靶點

在CTD數據里共收索到57059個AKI疾病靶點，選取推論分數值較高的靶點并結合文獻挖掘數據的方法收集基因，經整合去重后共得到496個疾病靶點，如TNF、BAX、NOS2、TGFB1等。

2.4 化合物靶點與AKI疾病靶點Venn分析

圖2示，將防己茯苓湯中273個化合物靶點與AKI中496個疾病靶點進行Venn分析，得到共同的基因集共58個靶點，如PTGS1、RELA、HMGCR、CYP1A2等。

圖2 化合物靶點與疾病靶點Venn圖

2.5 防己茯苓湯靶點PPI網絡的構建與分析

圖3、4示，為進一步研究防己茯苓湯的作用機制，本研究基于蛋白互作關系，使用STRING數據庫，對“2.4”項得到的58個基因集構建了防己茯苓湯PPI網絡圖。經置信度設置為>0.90后得到PPI網絡包含58個靶蛋白節(jié)點，100條表示靶標蛋白之間作用關系的邊。根據節(jié)點的Degree繪制出前10個關鍵靶蛋白節(jié)點的柱形圖。Degree排名前4的靶蛋白為SRC蛋白(SRC)、人源重組蛋白(HSP90AA1)、細胞核因子kp65蛋白(RELA)、蛋白激酶(AKT1)。其中Degree值較高的靶點蛋白是SRC蛋白(Degree=15)，說明在PPI網絡中SRC蛋白發(fā)揮關鍵作用，成為網絡中其他蛋白節(jié)點相互連通的紐帶。

圖3 防己茯苓湯靶蛋白PPI網絡

圖4 PPI網絡中的關鍵靶蛋白

2.6 GO富集與KEGG通路富集分析

圖5～7示，為闡明防己茯苓湯治療AKI的生物學功能，使用DAVID數據庫對“2.4”項篩選出的58個基因進行GO和KEGG分析。GO分析是一種基因功能分類體系，能夠衡量多個物種的基因功能，它分別從生物學過程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和細胞組件(Cellular Com-ponent，CC) 3個不同層面對靶點基因進行功能定義分析。通過GO分析顯示，BP、MF、CC所查到的條目分別為201個、76個、28個，根據Benjamini校正法篩選P<0.01的GO條目，經校正后分別得到BP條目28個，MF條目25個，CC條目5個，并分別繪制條形圖。由圖可知，BP值靠前的有一氧化氮生物合成過程(GO:0006809)、負調控凋亡過程(GO:0043066)和缺氧反應(GO:0001666)；MF中血紅素結合(GO:0020037)所占比例最大，其次為ATP酶活性與物質跨膜運輸(GO:0042626)；在CC中，防己茯苓湯活性成分作用的靶點主要富集在細胞質核周區(qū)(GO:0048471)和蛋白質復合物(GO:0043234)。KEGG富集分析通過查找靶點蛋白在通路中的分布情況，以進一步了解該蛋白在不同通路中發(fā)揮的作用。經KEGG分析共得到62條信號通路，將信號通路的相關數據導入Omicshare 平臺，得到靶蛋白排名前20的通路氣泡圖(圖8)。圖中氣泡大小表示該條通路富集到的靶點數量，氣泡顏色的深淺表示靶蛋白在該條通路富集程度的高低。富集靶點數量多且富集程度高的通路是雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、癌癥通路(Pathways in cancer)、VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、膽汁分泌(Bile secretion)、癌癥中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)。

圖5 靶點GO-BP富集分析

圖6 靶點GO-MF富集分析

圖7 靶點GO-CC富集分析

圖8 防己茯苓湯相關靶點KEGG富集氣泡圖

3 討論

AKI是一種臨床上常見的危急重癥，其病理生理機制復雜。目前對其機制的研究主要集中在腎血流動力學改變、免疫炎癥反應、基因多態(tài)性及細胞凋亡等方面，其中以腎血流動力學改變貫穿始終[9]。AKI在中醫(yī)中未有確切病名，但就其水腫、無尿、少尿等臨床表現屬于“水腫”“癃閉”“關格”“溺毒”等范疇。中醫(yī)認為AKI的發(fā)生多與外感六淫邪毒、內傷情志、瘀濁內蘊、久病體虛、藥毒中傷等因素有關。其病機以本虛標實為主，發(fā)病機理責于肺脾腎三臟功能失司。防己茯苓湯是《金匱要略》治療水氣病的經典要方，該方現代臨床應用廣泛，主要用于慢性腎炎性水腫、急性腎損傷、心臟病性水腫、肝硬化腹水、下肢靜脈血栓性水腫等疾病的治療[10-11]。研究表明，防己茯苓湯能夠降低β2-微球蛋白、Cys C水平來治療AKI且療效顯著[12]。蘇中昊等實驗研究指出，防己茯苓湯通過抑制KIM-1和NGAL蛋白的表達來防治AKI[13]。現代藥理研究表明，在防己茯苓湯中，防己含有多種生物堿，具有抗腎間質纖維化、抗炎、降壓、松弛平活肌等作用[14]；茯苓中的多糖類作為醛固酮受體拮抗劑而發(fā)揮利尿作用，同時還能消除氧自由基，提高機體免疫[15]；桂枝中的桂皮醇能夠利尿消腫、解熱鎮(zhèn)痛和消除炎性腫脹等[16]；黃芪中的皂苷類及黃酮類通過促進組織修復，防止腎小管壞死，降低血肌酐及尿素氮水平等來防治腎損傷[17]。而防己茯苓湯發(fā)揮抗AKI的具體作用機制如何，是否與化合物作用于該疾病的靶點，或者參與信號通路的調控有關，目前未見相關的研究及報道。

網絡藥理學是在現代藥理學研究的基礎上，以系統生物學研究手段，對疾病和藥物之間的作用機制進行系統網絡分析。本研究通過網絡藥理學技術，依托化合物、靶點蛋白、疾病和生物信息等多個數據庫，構建化合物靶點疾病網絡并進行靶點及通路的富集分析，深入探究傳統經方防己茯苓湯防治AKI的作用機制。經藥物的化學成分分析，共收集到127種活性化合物及對應靶點273個，經生物利用度篩選，得到與化合物關系密切的靶點有異黃酮、甘氨醇、三羥基-5-甲氧基-3-芳基香豆素、地衣吡喃香豆素、菜豆酚等。對防己茯苓湯靶點和AKI靶點進行PPI網絡構建，并分析其網絡構建結果得出與AKI聯系密切的靶點。如中性粒細胞脂質運載蛋白(NGAL)、腎損傷分子-1(KIM-1)、SRC蛋白(SRC)、蛋白激酶(AKT1)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)等。中性粒細胞脂質運載蛋白(NGAL)在AKI中意義顯著，研究表明在AKI患者中，尿NGAL水平在肌酐水平上升之前已顯著升高，故NGAL可作為AKI早期監(jiān)測的生物學標志物[18]。GO富集分析結果表明，防己茯苓湯對AKI的防治主要在一氧化氮生物合成、負調控凋亡、缺氧反應、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控等生物學過程中發(fā)揮作用；在分子功能上，通過血紅素結合、ATP酶活性與物質跨膜運動、類固醇激素受體活性等參與；在細胞組件中，通過細胞質核周區(qū)、蛋白質復合物、細胞器膜等來體現。KEGG富集分析結果顯示，防己茯苓湯治療AKI涉及血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)信號通路、低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)信號通路、雌激素信號通路和癌癥信號通路等。研究表明，腎組織在缺血缺氧的環(huán)境下HIF-1α表達水平持續(xù)升高，并進一步介導其下游對缺氧敏感的VEGF蛋白的活化，使VEGF蛋白表達增加進而影響腎小球基底膜的電荷屏障，使腎小球濾過膜的通透性增加，血漿蛋白濾過增多，從而導致尿蛋白并參與AKI的發(fā)生發(fā)展[19]。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，對防己茯苓湯經方多成分、多靶點、調控多條信號通路與AKI的關系進行研究。研究結果初步揭示了防己茯苓湯防治AKI的藥理學作用及相關機制，為進一步深究其潛在的作用機制及臨床運用奠定了良好基礎，為AKI的治療提供了新的思路。但本研究也存在一定的局限性，在研究途中未考慮藥物的用量、煎煮方式以及藥物在體內的代謝情況等因素的影響，因此所得結果尚需更深入的研究與探討。