高澤汝，劉昆侖*，陳復(fù)生

河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院（鄭州 450001）

玉米是我國重要的糧食作物，2018年我國玉米總產(chǎn)量達(dá)25 717萬 t，位于糧食作物首位。玉米胚芽是玉米籽粒的生命之源，富含優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素以及人體所需的生理活性物質(zhì)，營養(yǎng)價值極高[1]。目前，玉米胚芽主要用作制油原料，副產(chǎn)物胚芽粕由于常作為飼料處理，不僅生產(chǎn)效益較低，同時造成優(yōu)質(zhì)蛋白資源的極大浪費(fèi)[2]。

玉米胚芽蛋白中含有人體所需的全部必需氨基酸[3]，具有較高的生物價（BV），僅次于雞蛋（94%）和牛奶（85%）[4]，其蛋白質(zhì)功效比值（PER）高達(dá)2.56，與大豆蛋白（2.32）、酪蛋白（2.5）媲美[5]。玉米胚芽蛋白中以清蛋白和球蛋白含量為主，還有少量的谷蛋白和膠蛋白[6]。同時玉米胚芽蛋白具有優(yōu)越的功能性質(zhì)，如吸油、起泡、延展、乳化、持水能力、凝膠作用等，在食品工業(yè)生產(chǎn)中，是一種非常理想的蛋白質(zhì)配料，具有廣闊的開發(fā)及應(yīng)用前景[7]。

此次試驗(yàn)以玉米胚芽為原料，堿法提取玉米胚芽蛋白，探究料液比、溫度、堿溶時間、pH對蛋白提取的影響。采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件，確定最佳提取工藝，為玉米胚芽蛋白的提取提供借鑒，同時為玉米胚芽蛋白質(zhì)資源的精深加工提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米胚芽（脫脂后蛋白含量為25%，山東三星玉米產(chǎn)業(yè)科技有限公司）；正己烷（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；硫酸、鹽酸（洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

ST-07B多功能粉碎機(jī)（上海樹立儀器儀表有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；TDL-5-A型臺式低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；LGJ-25E冷凍干燥機(jī)（四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司）；K1100全自動凱式定氮儀（山東海能科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

對玉米胚芽進(jìn)行初步篩選，然后使用萬能粉碎機(jī)粉碎，按料液比1︰8（g/mL）加入正己烷，振蕩脫脂，重復(fù)3次，置于通風(fēng)櫥晾干，過60目篩，于-20℃干燥避光處密封保存，備用。

1.3.2 玉米胚芽原料成分的測定

水分含量的測定參照GB 5009.3—2016；灰分含量的測定參照GB 5009.4—2016；底物總蛋白質(zhì)含量的測定參照GB/T 5009.5—2016；脂肪含量的測定參照GB/T 5009.6—2016。

1.3.3 玉米胚芽蛋白提取工藝流程

取30 g玉米胚芽脫脂粉于燒杯中，以料液比1︰15（g/mL）加入去離子水，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至9.5，在50 ℃恒溫水浴鍋中連續(xù)攪拌120 min，以4 000 r/min離心20 min，取上清液，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.8，靜置30 min后，以5 000 r/min離心15 min，棄去上清液，將沉淀水洗至中性，冷凍干燥，即得到玉米胚芽蛋白。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

選擇料液比（1︰10，1︰15，1︰20，1︰25和1︰30 g/mL）、溫度（40，45，50，55和60 ℃）、pH（7，8，9，10和11）和堿溶時間（60，90，120，150和180 min）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探究其對玉米胚芽蛋白提取率的影響。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 蛋白提取率的測定

采用凱氏定氮法（參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》）測定蛋白質(zhì)含量，蛋白的提取率按式（1）計(jì)算。

蛋白提取率=（M1C1/M0C0）×100% （1）式中：M1為提取蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；C1為提取蛋白質(zhì)的含量，%；M0為樣品質(zhì)量，g；C0為樣品蛋白質(zhì)含量，%。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)對單因素試驗(yàn)的分析，選取料液比（A）、溫度（B）、時間（C）為優(yōu)化變量，響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。保持堿提pH 9.5，以玉米胚芽蛋白提取率為指標(biāo)，采用三因素三水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行玉米胚芽蛋白提取試驗(yàn)。因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值。結(jié)果采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性檢驗(yàn)水平p=0.05；利用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果分析及預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米胚芽主要成分分析

玉米胚芽成分測定結(jié)果見表2。由表2可知：玉米胚芽中蛋白含量較高，可以作為試驗(yàn)原材料。

表2 玉米胚芽主要成分

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對蛋白提取率的影響

由圖1可以看出，隨著料液比的變化，蛋白提取率隨之呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。蛋白質(zhì)的提取率在料液比1︰15（g/mL）時最高，當(dāng)料液比繼續(xù)增加后，蛋白提取率不斷下降，此結(jié)果與任秀艷等[8]的研究結(jié)果相似。當(dāng)料液比過低時，提取體系的過于濃稠，蛋白質(zhì)無法充分溶出，隨著提取的料液比的增大，脫脂粉在溶液中分散得越充分，越有利于反應(yīng)的進(jìn)行[9]。從生產(chǎn)成本以及提取效果上考慮，高料液比不適于蛋白的提取[10]。故選取提取料液比為1︰15（g/mL）。

圖1 料液比對蛋白提取率的影響

2.2.2 時間對蛋白提取率的影響

由圖2可以看出，隨著提取時間的增加，蛋白的提取率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，但堿溶時間在150～180 min時，提取率增加趨勢減緩。原因可能是隨著時間的增加，玉米胚芽蛋白分子在堿溶液中的溶解度不斷增加，最終達(dá)到一個平衡的狀態(tài)，體系的蛋白組分不再溶出[11]。另外，提取時間過長會破壞蛋白質(zhì)在溶液中的熱穩(wěn)定性，使蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)以及顏色發(fā)生變化。綜合考慮經(jīng)濟(jì)、效率等因素，選擇150 min為最佳堿溶時間。

2.2.3 pH對蛋白提取率的影響

由圖3可以看出，隨著pH的升高，玉米胚芽蛋白的提取率顯著提高。這是由于堿性環(huán)境使得蛋白質(zhì)與水分子之間作用增大，蛋白質(zhì)的溶解性隨之提高。另外，玉米胚芽蛋白組成中堿溶蛋白高達(dá)79.9%，堿性條件有利于蛋白的提取[12]。但是，過強(qiáng)的堿性條件會使蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變化，甚至轉(zhuǎn)化成可能有毒的氨基酸，降低蛋白質(zhì)的應(yīng)用性[13]。綜合考慮，選擇pH 9.5較優(yōu)。

圖2 時間對蛋白提取率的影響

圖3 pH對蛋白提取率的影響

2.2.4 溫度對蛋白提取率的影響

由圖4可知，隨著溫度的增加，蛋白提取率呈不斷增加后下降的趨勢。當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時，提取率達(dá)到最高，顯著高于其他水平（p＜0.05）。原因可能是在40 ℃增加到55 ℃的過程中，溫度不斷升高，分子活動加劇，溶質(zhì)的擴(kuò)散能力加大，同時溶液的黏度降低，蛋白質(zhì)的溶解度增加，從而提取率升高[14]。而溫度達(dá)到60 ℃后，高溫條件使得溶液中的淀粉分子發(fā)生糊化反應(yīng)，黏度增大的糊狀溶液導(dǎo)致提取的蛋白質(zhì)難以繼續(xù)溶解，所以蛋白質(zhì)的提取率降低[15]。此外，溫度過高促使結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而影響蛋白在食品中的功能性質(zhì)。因此，選擇較合適的堿提溫度55 ℃。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)及結(jié)果分析

2.3.1 回歸模型分析

采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以蛋白提取率為指標(biāo)，利用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，試驗(yàn)組合與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

圖4 溫度對蛋白提取率的影響

表3 試驗(yàn)組合及結(jié)果

表4 響應(yīng)面方差分析

料液比（A）、溫度（B）、時間（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=52.23+2.47A+3.25B+0.75C+0.51AB-1.1AC+0.035BC-2.82A2-5.46B2-3.21C2。

由表4可知，此回歸模型是極顯著的（p＜0.001）；同時該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.995 3，校正系數(shù)R2Adj=0.989 3，說明模型置信度高，蛋白提取率與各因素間線性關(guān)系顯著。因此，可通過回歸方程確定玉米胚芽蛋白提取最優(yōu)參數(shù)。模型中選取的關(guān)鍵因素均對蛋白提取率影響顯著或極顯著，A與C的交互影響表現(xiàn)為差異極顯著，其余項(xiàng)差異均不顯著。此外，通過F檢驗(yàn)值可以得知各因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，F(xiàn)值越大，表明對試驗(yàn)結(jié)果的貢獻(xiàn)率越大。因此，根據(jù)表3的F值得知，3個因素對蛋白提取率的影響程度依次為B＞A＞C，即溫度＞料液比＞時間。

2.3.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面的走向，可以反映出所選因素以及因素間的相互作用對玉米胚芽蛋白的提取率的影響。曲線的走勢越明顯陡峭，幅度越大，說明該因素對蛋白提取率的影響越大，反之，則影響越小。由圖5可知，當(dāng)溫度（B）確定時，料液比（A）與時間（C）的交互作用對蛋白提取率的影響顯著；料液比（A）與溫度（B）的交互作用較為明顯；溫度（B）和時間（C）交互作用不顯著，溫度（B）和時間（C）的交互作用不顯著，可能是該因素的主效應(yīng)對試驗(yàn)結(jié)果的影響大于交互作用。結(jié)果表明，對玉米胚芽蛋白提取率影響最大的是溫度，其次是料液比和時間，這與表4中回歸分析結(jié)果是一致的。

圖5 各因素交互作用響應(yīng)面圖

2.3.3 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證

通過Design-Expert 8.0.6軟件對回歸方程的分析計(jì)算，得到提取玉米胚芽蛋白的最佳條件：料液比1︰18（g/mL），溫度53 ℃，堿提時間122 min。采用此最佳工藝進(jìn)行實(shí)際操作，證明得到提取率為54.36%，與預(yù)測值53.25%接近，說明該回歸模型適用于對試驗(yàn)結(jié)果的分析預(yù)測。

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)探究了料液比、溫度、堿溶時間、pH對玉米胚芽蛋白提取率的影響，并采用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)分析試驗(yàn)，得到最優(yōu)蛋白提取工藝：料液比1︰18（g/mL）、溫度53 ℃、pH 9.5、堿溶時間122 min。經(jīng)實(shí)際操作，蛋白提取率為54.36%。此次試驗(yàn)為玉米胚芽蛋白的提取提供了借鑒，同時為玉米胚芽蛋白質(zhì)資源的精深加工提供了理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)參考。