張培旗，侯佩*，常志娟，縱偉*

鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（鄭州 450002）

葉綠素是一種天然、安全，且具有一定生理功能的天然色素[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素有重要的生理活性，如抗致突變、降解膽固醇、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和改善便秘等作用[2]。但是，由于葉綠素的不穩(wěn)定性，致使其難于在食品工業(yè)中應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，銅離子取代葉綠素中鎂離子制成葉綠素銅鈉鹽，不但可以增強化合物穩(wěn)定性，而且仍具有與葉綠素類似的色澤和生理功能[3]。試驗以小麥草為原料，探討了小麥草葉綠素提取及制備葉綠素銅鈉鹽的生產(chǎn)工藝，為小麥草的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥草由實驗室培養(yǎng)。氫氧化鈉、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸鈉、石油醚、丙酮、無水乙醇均為分析純。

SP-2100可見分光光度計UV（上海光譜儀器有限公司）；AL204電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；TDZ5-WS湘儀離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 工藝流程

小麥草→預(yù)處理→有機溶劑浸提→濃縮皂化→萃取分離→酸化→銅代→過濾→成鹽→干燥→成品

1.2.1 小麥草樣品前處理

將新鮮小麥草用蒸餾水清洗干凈，晾干。然后用剪刀剪碎置于冷凍干燥機內(nèi)冷凍干燥14 h，用粉碎機粉碎過100目，粉碎后的小麥草放于棕色試劑瓶內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 濃縮皂化

將提取液水浴濃縮至原體積的1/2，濃縮不但可以減少萃取過程所用萃取劑的用量，而且有利于進(jìn)一步生成葉綠素銅酸。濃縮后加入10%的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至11，然后水?。?0 ℃）加熱，攪拌回流60 min，進(jìn)行皂化反應(yīng)。皂化情況可采用石油醚進(jìn)行檢驗，如果加入2～3滴石油醚搖勻上層不呈現(xiàn)綠色，說明皂化完全；否則，要通過增加堿量并延長皂化時間使其徹底皂化。

1.2.3 萃取分離

將皂化液冷卻移入分液漏斗中，加入一定體積石油醚，充分振蕩2 min，靜置分層。葉綠素鹽皂化液主要集中在下層，萃取至醚層呈淡淡的黃色，一般萃取4～5次。

1.2.4 酸化制銅

向葉綠素皂化液中滴加稀硫酸調(diào)整pH 2～3，于60℃水浴加熱，葉綠素充分酸化后變成黃褐色的脫鎂葉綠酸。將酸化后的葉綠素提取液轉(zhuǎn)入燒杯匯總，滴加10%硫酸銅水溶液，當(dāng)溶液顏色整體由黃綠變?yōu)槟G時，再多加3 mL硫酸銅溶液。在不斷攪拌的條件下，使銅離子逐步取代葉綠素酸中的鎂離子，然后置于60℃的水浴中回流60 min。所得葉綠素銅酸要用蒸餾水反復(fù)洗滌以除去水溶性雜質(zhì)。

1.2.5 成鹽

將上述葉綠素銅酸用丙酮溶解，加入10% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至12，在室溫下攪拌反應(yīng)60 min，靜置，有墨綠色的葉綠素銅鈉鹽沉淀生成，過濾沉淀于60 ℃烘干，得到墨綠色有金屬光澤的葉綠素銅鈉鹽粉末。

1.3 葉綠素含量的測定與計算

葉綠素a、葉綠素b分別于645和663 nm有兩處吸收峰，用分光光度法測定葉綠素含量主要依據(jù)Arnon公式[4]，其計算方法是：分別以提取溶劑作空白，測定葉綠素提取液吸光度A645和A663，根據(jù)式（1）～（3）計算葉綠素總含量。式中：A645和A663分別為樣品稀釋液在波長為645和663 nm時的吸光度；n為稀釋倍數(shù)；V為樣品溶液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 葉綠素提取劑的選擇

采用無水乙醇和丙酮，按體積比混合作為溶劑從小麥草粉中提取葉綠素，通過多次單因素試驗和正交試驗，對影響提取工藝的因素進(jìn)行優(yōu)化，確定葉綠素提取最佳工藝。精確稱取5份2.00 g粉碎好的小麥草，分別加入30 mL不同溶劑的錐形瓶中，加蓋，避光，室溫提取2 h，離心。取1 mL提取液，用無水乙醇稀釋定容到25 mL，在λmax=645 nm和λmax=663 nm處測定吸光度A，根據(jù)Aron公式計算葉綠素總含量，試驗結(jié)果如圖1所示。采用無水乙醇和丙酮混合溶劑比單一選用無水乙醇或丙酮溶劑有更好的提取效果，當(dāng)無水乙醇和丙酮體積比2︰1時，提取效果最好，為1.808 1 mg/g。因此選取該混合試劑作為提取劑。

圖1 葉綠素提取劑的選擇

2.2 小麥草葉綠素提取的優(yōu)化

2.2.1 料液比對麥草葉綠素提取的影響

料液比與葉綠素總含量的關(guān)系曲線如圖2所示。隨著料液比的增大，提取率逐漸增加，達(dá)到7倍的溶劑用量后，提取率趨于穩(wěn)定。說明當(dāng)料液比為1︰7（g/mL）時，葉綠素已得到充分提取。

圖2 料液比對提取葉綠素含量的影響

2.2.2 提取時間對麥草葉綠素提取的影響

提取時間與葉綠素總含量的關(guān)系曲線如圖3所示。在3～5 h，隨提取時間的延長，葉綠素的提取率逐漸升高；5 h后，葉綠素的提取率隨時間延長而開始下降。這說明5 h后，麥草中葉綠素向提取溶劑的擴散已達(dá)到平衡；此外，葉綠素對熱不穩(wěn)定，加熱一定時間后便開始分解，因此含量不斷下降。

圖3 時間對提取葉綠素含量的影響

2.2.3 溫度對麥草葉綠素提取的影響

提取溫度與葉綠素總含量的關(guān)系如圖4所示。在20～50 ℃，麥草葉綠素提取率隨著浸提溫度的升高而升高；隨后，隨著浸提溫度的升高，葉綠素提取率隨溫度增加呈下降趨勢。這說明麥草葉綠素在高溫（50℃）開始變得不穩(wěn)定，容易分解。

圖4 溫度對提取小麥草葉綠素含量的影響

2.2.4 葉綠素提取的正交試驗結(jié)果及分析

提取時間、料液比和提取溫度對小麥草葉綠素提取影響的正交試驗結(jié)果見表1。各因素的主次順序為C＞A＞B，各因素的最優(yōu)水平組合為C3A1B3，即提取溫度為60 ℃，提取時間4 h，料液比為1︰8（g/mL），此時提取效果最好。

表1 正交設(shè)計試驗結(jié)果和極差分析

2.3 葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性

2.3.1 小麥草葉綠素銅鈉鹽吸收光譜曲線

取葉綠素銅鈉鹽，用150 mL蒸餾水溶解；吸取5 mL，用蒸餾水定容到50 mL容量瓶中。以蒸餾水作為空白對照，測葉綠素銅鈉在340～690 nm范圍內(nèi)的吸光度。從圖5可以看出，在406和628 nm處有吸收峰，這與向洪平等[5]的試驗基本一致。同時可以確定葉綠素銅鈉鹽的最大吸收峰的波長為406 nm。

圖5 葉綠素銅鈉鹽吸收光度譜圖

2.3.2 溫度對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

葉綠素銅鈉鹽溶液在不同溫度的水浴上保持5 min，吸光度（A406nm）的變化結(jié)果見圖6。葉綠素銅鈉鹽溶液在80 ℃以下時，吸光度的變化不大，即穩(wěn)定性較好；加熱至80 ℃以上時，有輕微渾濁，吸光度急劇下降，說明此時葉綠素銅鈉鹽變得不穩(wěn)定。

2.3.3 pH對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

改變?nèi)~綠素銅鈉鹽水溶液pH后測定其A406nm，結(jié)果見圖7。當(dāng)pH 6～8時，吸光度最大，溶液顏色最深，說明葉綠素銅鈉鹽在中性介質(zhì)附近是穩(wěn)定的；當(dāng)pH＜6時，吸光度急劇下降，說明葉綠素銅鈉鹽在酸性介質(zhì)中非常不穩(wěn)定；當(dāng)pH 8～12時，吸光度下降較少，說明葉綠素銅鈉鹽在堿性介質(zhì)中相對穩(wěn)定。

2.3.4 光線對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

將一定濃度的銅鈉鹽放置于一個光照的地方，每天按時測定溶液的A406nm，結(jié)果見圖8。隨著光照時間的延長，溶液的吸光度逐漸下降。這說明光線可影響葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性，應(yīng)避光保存。

圖6 溫度對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

圖7 pH對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

圖8 光線對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論與討論

在無水乙醇與丙酮體積比為2︰1的情況下提取效果最好，單一有機溶劑提取率較低，說明在葉綠素提取過程中無水乙醇和丙酮有協(xié)同作用。小麥草葉綠素的最優(yōu)提取工藝為：溫度60 ℃，時間4 h，料液比1︰8（g/mL）。此時葉綠素含量最高，為15.91 mg/g。由試驗可知，小麥草葉綠素含量高于苦瓜[6]、仙人掌[3]及絞股藍(lán)[7]中提取的葉綠素含量，因此，小麥草可作為葉綠素提取的理想原料。葉綠素銅鈉在溫度低于80℃、pH 6～8的條件下是很穩(wěn)定的，銅鈉鹽對光線的穩(wěn)定性較差，應(yīng)避光保存。