夏能志，胡子龍，黃群，鄭宏，高紅昌，楊運(yùn)俊，李建策

（1．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射影像中心，浙江 溫州 325015；2．溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 代謝組學(xué)與醫(yī)藥核磁共振研究所，浙江 溫州 325035）

目前采用短暫性或永久性大腦中動(dòng)脈閉塞 （middle cerebral artery occlusion，MCAO）法建立局灶性腦缺血模型，是開(kāi)展缺血性腦血管病實(shí)驗(yàn)研究的重要基礎(chǔ)[1-3]。有研究表明，短暫性MCAO（tMCAO）和永久性MCAO（pMCAO）模型在幕上大腦組織神經(jīng)元損傷、炎癥、氧化應(yīng)激、代謝等方面存在差異，但針對(duì)幕下小腦的相關(guān)研究尚少[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，幕上局灶性腦損傷后可引起對(duì)側(cè)小腦出現(xiàn)繼發(fā)性的功能改變，表現(xiàn)為對(duì)側(cè)小腦血流量減少和代謝減低[6-8]。本研究應(yīng)用基于核磁共振氫譜（1H NMR）的代謝組學(xué)技術(shù)探討tMCAO和pMCAO大鼠對(duì)側(cè)小腦的代謝變化，為腦缺血的早期診治提供準(zhǔn)確的生物化學(xué)信息。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組 選取64只健康雄性SD大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），清潔級(jí)，體質(zhì)量250～320 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后分為對(duì)照組（CON，n=12）、pMCAO組（n=29）和tMCAO組（n=23）。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水、進(jìn)食，室溫保持（22±3）℃，相對(duì)濕度為（60±10）%，晝夜保持12 h交替變化。

1.2 腦缺血模型制備

1.2.1 大鼠pMCAO模型的建立：參照傳統(tǒng)的LONGA法并加以改良[9]。①術(shù)前禁食，稱體質(zhì)量后10%水合氯醛（0.25 mL/100 g）進(jìn)行腹腔注射麻醉，頸部備皮、消毒；②頸部正中皮膚作一長(zhǎng)約2 cm縱行切口，剪開(kāi)淺筋膜、鈍性分離頸部肌肉，暴露并分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA）、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）以及與CCA伴行的迷走神經(jīng)，于CCA遠(yuǎn)心端和近心端及ECA處掛線備用；③顯微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA，CCA近心端及ECA結(jié)扎，于距CCA分叉部4～5 mm處剪一0.2 mm的“V”字型切口，將直徑為0.26 mm的MCAO栓線經(jīng)切口緩慢插入CCA；④將栓線沿著ICA緩緩送入MCA近端，以栓線上特制的黑色標(biāo)記點(diǎn)剛好到達(dá)ICA與ECA分叉處，且進(jìn)線遇阻力時(shí)停止進(jìn)線，栓線插入深度從CCA分叉處開(kāi)始計(jì)算約（18.0±1.5）mm，此時(shí)栓線頭端恰位于MCA起始部；⑤結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端將栓線固定以防其滑脫，剪掉血管外多余栓線；⑥逐層縫合肌肉、腺體和皮膚，局部使用抗生素防感染。

1.2.2 大鼠tMCAO模型的建立：腦缺血2 h后，追加10%水合氯醛（0.1 mL/100 g）再次麻醉大鼠，拔出栓線。其余步驟同pMCAO模型操作。

1.2.3 CON組：頸部組織切開(kāi)后，僅分離CCA、ICA和ECA，不插入栓線。其余步驟同pMCAO模型操作。

1.3 模型評(píng)價(jià)

1.3.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：參考LONGA等[9]確立的5級(jí)（0～4分）評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分，分?jǐn)?shù)越高，說(shuō)明其神經(jīng)行為缺損越嚴(yán)重。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢；2分，行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，站立不穩(wěn)，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能獨(dú)立行走，意識(shí)喪失。評(píng)分1～3分的SD大鼠納入實(shí)驗(yàn)。CON組則均不出現(xiàn)以上任何類(lèi)似癥狀。

1.3.2 磁共振成像評(píng)價(jià)：造模成功后24 h，使用 3.0 T（Philips Achieva）超導(dǎo)高場(chǎng)磁共振掃描儀及4通道大鼠專(zhuān)用線圈，行軸位T1WI、T2WI檢查。掃描參數(shù)如下：快速自旋回波（turbo spin echo，TSE）序列T1WI：TE 20 ms，TR 2 000 ms，矩陣160× 160，F(xiàn)OV 40×40 mm，層厚1 mm，層間距0.12 mm，采集次數(shù)8次，掃描層數(shù)24，掃描時(shí)間4 min 32 s；T2WI：TE 80 ms，TR 3 198 ms，矩陣192×192，F(xiàn)OV 40×40 mm，層厚1 mm，層間距0.12 mm，采集次數(shù)8次，掃描層數(shù)24，掃描時(shí)間4 min 47 s。

1.4 腦組織的1H NMR檢測(cè) 依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和前期工作方法進(jìn)行NMR樣品準(zhǔn)備、1H NMR譜圖采集、NMR數(shù)據(jù)預(yù)處理和模式識(shí)別、代謝物含量計(jì)算[10-11]。

1.4.1 NMR樣品準(zhǔn)備和1H NMR譜圖采集：造模成功后7 d將大鼠斷頭、取腦，采用甲醇-氯仿-水提取法提取小分子代謝物制備N(xiāo)MR樣品。使用Bruker AVANCE III 600 MHz NMR譜儀檢測(cè)腦組織樣本的1H NMR譜圖，質(zhì)子共振頻率為600.13 MHz。探頭溫度控制為298 K，1H NMR采樣譜寬9 615 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)64 K，累加64次。采得的時(shí)域信號(hào)充零至64 K后進(jìn)行傅立葉變換，得到NMR譜。使用Topspin軟件對(duì)所有的1H NMR譜圖進(jìn)行細(xì)致的相位校正和基線調(diào)整，將乳酸的甲基峰的化學(xué)位移定為1.33 ppm。

1.4.2 NMR數(shù)據(jù)預(yù)處理及代謝物含量計(jì)算：以δ0.01為區(qū)間將1H NMR譜圖（δ10.000～-1.000）劃分為1 100個(gè)等寬的區(qū)域，并對(duì)各個(gè)區(qū)域進(jìn)行自動(dòng)積分，且將δ5.150～4.690區(qū)域設(shè)為0積分段，消除壓水峰時(shí)引起的譜線差異。歸一化處理將數(shù)據(jù)輸入SIMCA-P軟件包進(jìn)行PLS-DA分析，以第一和第二主成分（PC1和PC2）作為X、Y坐標(biāo)軸構(gòu)建二維空間（散點(diǎn)圖，Scatterplot）。利用Chenomx NMR suite 6.0歸屬各類(lèi)代謝物峰位置，再將各段積分相加且通過(guò)公式計(jì)算代謝物含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦缺血模型的建立及評(píng)價(jià) 所有實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前均無(wú)行為學(xué)異常，Longa法評(píng)分均為0分。本實(shí)驗(yàn)中建立的pMCAO和tMCAO模型大鼠，右前肢均有不同程度的活動(dòng)障礙。CON組大鼠均存活，pMCAO組大鼠存活率（24.1%，7/29）明顯低于tMCAO組（47.8%，11/23）。

各組大鼠頭顱MRI表現(xiàn)如圖1所示。pMCAO組大鼠左側(cè)大腦皮層及基底節(jié)區(qū)均可見(jiàn)T1WI低信號(hào)、T2WI高信號(hào)影，tMCAO組大鼠左側(cè)基底節(jié)區(qū)及部分大腦皮層可見(jiàn)T1WI低信號(hào)、T2WI高信號(hào)影。CON組大鼠左側(cè)大腦T1WI、T2WI未見(jiàn)異常信號(hào)。3組大鼠右側(cè)小腦T1WI、T2WI均未見(jiàn)異常信號(hào)。

圖1 大鼠頭顱MRI表現(xiàn)

2.2 小腦1H NMR譜圖及模式識(shí)別分析 大鼠小腦典型1H NMR譜圖如圖2所示，圖2E列出了CON組小腦中能被1H NMR檢測(cè)到的代謝物（N-乙酰基天冬氨酸：NAA；膽堿：Cho；乳酸：Lac；谷氨酸：Glu；谷氨酰胺：Gln；γ-氨基丁酸：GABA；丙氨酸：Ala；甘氨酸：Gly；天冬氨酸：Asp；肌酸：Cr；肌醇：m-Ins；琥珀酸：Suc；?；撬幔篢au）。對(duì)各組大鼠小腦1H NMR譜圖進(jìn)行模式識(shí)別分析，得到相應(yīng)樣本的PLS-DA散點(diǎn)圖（見(jiàn)圖2B、2D、2F）。兩兩組間大鼠小腦代謝物在第一主成分上均能夠明顯區(qū)分，表明小腦代謝模式存在顯著差異，說(shuō)明大腦缺血可影響對(duì)側(cè)小腦代謝，且腦缺血時(shí)長(zhǎng)對(duì)小腦代謝變化存在影響。

2.3 小腦代謝物含量 從表1中可以看出，pMCAO組較CON組大鼠對(duì)側(cè)小腦Ala、Lac含量顯著下降，而GABA、Gln、m-Ins、Asp、Cre含量顯著升高（P＜0.05）；tMCAO組較CON組大鼠對(duì)側(cè)小腦Ala、Lac含量顯著下降，而Glu、m-Ins、Asp、Cre含量顯著升高 （P＜0.05）；tMCAO組較pMCAO組大鼠對(duì)側(cè)小腦Gln含量顯著下降（P＜0.05）。MCAO大鼠對(duì)側(cè)小腦主要代謝通路變化情況如圖3所示。

3 討論

自BARON等[12]首次通過(guò)PET證實(shí)腦梗死患者對(duì)側(cè)小腦氧和葡萄糖低代謝以來(lái)，“交叉性小腦神經(jīng)機(jī)能聯(lián)系不能”現(xiàn)象受到越來(lái)越多的關(guān)注，但既往多采用PET、SPECT、CTP、DSC-PWI等手段研究小腦變化[13-16]。本研究應(yīng)用基于1H NMR的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)比研究tMCAO和pMCAO大鼠對(duì)側(cè)小腦的代謝變化。

本研究中無(wú)論短暫性或永久性腦缺血，對(duì)側(cè)小腦主要表現(xiàn)為L(zhǎng)ac、Ala降低，而m-Ins、Asp、Cre升 高。Lac是糖酵解的終產(chǎn)物，Ala在酶的催化下可轉(zhuǎn)變?yōu)楸釓亩鴧⑴c糖酵解，是體內(nèi)無(wú)氧酵解的標(biāo)志物[17-18]。Lac、Ala降低，可能是因?yàn)槟X缺血大鼠對(duì)側(cè)小腦低血流量導(dǎo)致能量底物葡萄糖減少所致。小腦能量需求減低，無(wú)氧酵解途徑亦減弱，這與既往研究[19]顯示小腦葡萄糖代謝減低相一致。Cre是細(xì)胞內(nèi)磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和能量緩沖系統(tǒng)的標(biāo)志物，在ATP不足時(shí)參與機(jī)體供能。Cre升高表明小腦能量?jī)?chǔ)備充足，這與小腦能量需求較低相適應(yīng)。m-Ins是反映膠質(zhì)細(xì)胞活性以及膠質(zhì)滲透壓調(diào)節(jié)的代謝 物[11，20]。m-Ins升高，表明小腦可能存在膠質(zhì)細(xì)胞增生或細(xì)胞活性升高，膠質(zhì)細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)的需求增強(qiáng)。興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Asp升高，表明低代謝小腦的神經(jīng)興奮性代償性增高。本研究中tMCAO組和pMCAO組大鼠對(duì)側(cè)小腦NAA均正常，表明對(duì)側(cè)小腦神經(jīng)元無(wú)明顯受損，與本研究MRI表現(xiàn)相一致。有學(xué)者對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者行MRS檢查后發(fā)現(xiàn)，對(duì)側(cè)小腦NAA顯著下降[21]。這可能與不同病因腦損傷所致對(duì)側(cè)小腦代謝改變不同有關(guān)。

圖2 大鼠小腦1H NMR譜圖（A、C、E）和PLS-DA圖（B、D、F）

表1 小腦代謝物含量（mmol/kg）

Gln-Glu-GABA循環(huán)是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元間神經(jīng)遞質(zhì)交換的主要途徑，該循環(huán)中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生變化都可能影響到與之相關(guān)的代謝物含量[5，22]。 膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體吸收神經(jīng)元釋放的Glu，在谷氨酰胺合成酶的作用下轉(zhuǎn)化成Gln，隨后Gln被轉(zhuǎn)運(yùn)回神經(jīng)元中并被谷氨酰胺酶水解成Glu，而GABA能神經(jīng)元中的Glu可以在谷氨酸脫羧酶的作用下形成GABA。本研究結(jié)果顯示，pMCAO組大鼠對(duì)側(cè)小腦GABA和Gln升高，而tMCAO組大鼠對(duì)側(cè)小腦Glu升高，表明短暫性和永久性腦缺血對(duì)小腦Gln-Glu-GABA循環(huán)代謝存在不同的影響。既往亦有研究表 明，急性期腦缺血可引起對(duì)側(cè)小腦Gln-Glu-GABA循環(huán)紊亂[23]。膠質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生的Gln是神經(jīng)元Glu和GABA合成的主要前體。本研究中tMCAO組較pMCAO組大鼠對(duì)側(cè)小腦Gln下降，表明Gln可能對(duì)不同時(shí)長(zhǎng)腦缺血所致對(duì)側(cè)小腦代謝改變較靈敏。

圖3 MCAO大鼠對(duì)側(cè)小腦代謝通路變化

綜上所述，短暫性和永久性腦缺血大鼠對(duì)側(cè)小腦代謝均發(fā)生顯著改變，主要涉及能量代謝（Lac、Ala）、神經(jīng)遞質(zhì)代謝（Glu、Gln、Asp、GABA）和膠質(zhì)細(xì)胞活性（m-Ins）。無(wú)論短暫性或永久性腦缺血，對(duì)側(cè)小腦主要表現(xiàn)為能量代謝降低、神經(jīng)興奮性升高和膠質(zhì)細(xì)胞活性增加。然而，不同時(shí)長(zhǎng)腦缺血對(duì)小腦Gln-Glu-GABA循環(huán)代謝存在不同的影響。