朱弋寶，范慶祝，呂曉梅，張 超，趙文英，劉曉平

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 藥物篩選與評(píng)價(jià)研究所，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 腫瘤科，安徽 蕪湖 241001)

硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)是目前研究發(fā)現(xiàn)唯一能還原細(xì)胞中硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)的酶，同時(shí)也是重要的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)清除酶。TrxR在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)中起重要作用，可保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受ROS蓄積所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。TrxR因其碳端有一個(gè)pKa值較低的Sec活性位點(diǎn)，很容易與親電試劑發(fā)生反應(yīng)。當(dāng)TrxR被結(jié)合修飾后，可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)。因此，TrxR有很大潛力成為抗腫瘤藥物開發(fā)的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 pET-TRSTER質(zhì)粒由Elias Arnér教授饋贈(zèng)(Addgene plasmid # 78865;http://n2t.net/addgene:78865;RRID:Addgene_78865)；大腸埃希菌E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自General Biosystems公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 重組人TrxR-ΔC蛋白(AA.151-647,刪除 C端硒半胱氨酸)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并表達(dá)純化；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Thermo公司)；大鼠肝臟提取TrxR蛋白(Sigma-Aldrich公司)；硫氧還蛋白還原酶抑制劑金諾芬(Auranofin)(美國(guó)MCE公司)；2′5′-ADP瓊脂糖凝膠(2′,5′-ADP Sepharose 4B)、AKTA Pure 5M(瑞典GE公司)；電泳儀、小型垂直電泳槽(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 pET-TRSTER質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和克隆 將pET-TRSTER重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至LB 固體培基(含50 μg/mL Kanamycin)，37 ℃ 過夜培養(yǎng)。挑選出大小合適的單克隆菌落，加入至5 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)，37℃，220 r/min，擴(kuò)菌。

1.2.2 TrxR重組蛋白的誘導(dǎo)溫度與時(shí)間的優(yōu)化 將表達(dá)菌接種于5 mL LB 液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kanamycin)中，設(shè)置誘導(dǎo)溫度為37℃，以0.05 mmol/L IPTG 分別誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集等量的菌體，以10% SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，觀察TrxR重組蛋白的表達(dá)量。將誘導(dǎo)溫度設(shè)置為25℃，重復(fù)上述操作。

1.2.3 TrxR重組蛋白的可溶性分析 破菌裂解液重懸菌體，置于冰水混合物中。超聲破碎30 min，至菌液澄清。10 000 r/min，4℃離心，分別留取上清液和沉淀，制作樣品，10% SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色。觀察沉淀和上清液中目的蛋白的含量。

1.2.4 TrxR重組蛋白的純化和鑒定 將破碎完的菌液10 000 r/min，4℃ 離心10 min，0.22 μm濾過膜濾過。用AKTApurifier蛋白純化系統(tǒng)純化蛋白，梯度濃度的氯化鈉溶液(起始濃度為100 mmol/L NaCl)洗脫。10% SDS-PAGE凝膠電泳，選出最佳洗脫濃度。

1.2.5 TrxR重組蛋白的活性分析 用DNTB法[1]檢測(cè)TrxR重組蛋白、天然鼠肝TrxR蛋白和TrxR-ΔC蛋白3種蛋白的蛋白活性。對(duì)應(yīng)加入不同濃度的藥物和NADPH預(yù)還原的蛋白于孔板中，在室溫下孵育，加入配制好的DNTB和NADPH混合液，立即測(cè)定412 nm處的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 TrxR重組蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度與時(shí)間 表達(dá)菌經(jīng)不同誘導(dǎo)溫度和時(shí)間培養(yǎng)后，離心收集等量菌液，用10% SDS-PAGE 和Clinx Image Analysis 軟件分析TrxR重組蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)，目的蛋白的誘導(dǎo)效果不明顯(圖1A)；誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí)，14 h時(shí)TrxR重組蛋白表達(dá)量約為23.48%并趨于穩(wěn)定，考慮IPTG長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)，對(duì)表達(dá)菌有一定的毒性作用，從而選擇14 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間(圖1B)?？梢姡琓rxR重組蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度為25 ℃，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為14 h。

A：誘導(dǎo)溫度 37℃；B：誘導(dǎo)溫度25℃；M：蛋白Maker；C：對(duì)照；1～7：誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)：0 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h。

2.2 TrxR重組蛋白的可溶性分析 破碎誘導(dǎo)不同時(shí)間后的菌體，通過SDS-PAGE凝膠電泳，觀察上清液與沉淀中的目的蛋白的含量，比較不同誘導(dǎo)時(shí)間后的上清溶液中TrxR蛋白的含量差異。結(jié)果顯示：3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的目的蛋白大部分存在于上清液中，且上清液中的目的蛋白表達(dá)量基本相同(圖2)。

M：蛋白Maker；1：沉淀對(duì)照；2：12 h 沉淀；3：14 h 沉淀；4：16 h沉淀；5：上清液對(duì)照；6：12 h 上清液；7：14 h上清液；8：16 h 上清液。

2.3 TrxR蛋白的純化與鑒定 應(yīng)用親和層析的方法，使用上樣緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0,A液)和1 mol/L氯化鈉鹽溶液(B液)混合進(jìn)行梯度洗脫，得到目的蛋白，并用10% SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行純化后的蛋白純度分析(圖3)。當(dāng)混合洗脫液中的B液濃度由10%升至30%和50%升至70%時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)洗脫峰，經(jīng)由SDS-PAGE驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)洗脫峰均為TrxR蛋白。而50%～70%洗脫峰收集的蛋白濃度遠(yuǎn)大于10%～30%洗脫峰所收集蛋白。我們推測(cè)可能是目的蛋白表達(dá)量大，超過柱載量上限，所以部分目的蛋白和柱子結(jié)合不牢，在含低濃度氯化鈉的洗脫液中被洗滌下來，導(dǎo)致出現(xiàn)10%～30%處的洗脫峰，綜上確定最佳混合洗脫液為含有50%～70%的B液。運(yùn)用BCA蛋白定量法測(cè)定純化的TrxR重組蛋白濃度為3.2 g/mL。

M：蛋白Maker；1:流穿峰；2～10：混合洗脫液中含有1 mol/L氯化鈉溶液的終濃度分別為20 %、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。

2.4 3種蛋白的活性比較 結(jié)果顯示，當(dāng)測(cè)量時(shí)間為30 s時(shí)，3種蛋白之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)測(cè)量時(shí)間為60 s和90 s時(shí)，TrxR和pET-TRSTER之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均高于 TrxR-ΔC的吸光度(P<0.05)。其他8個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)，TrxR的吸光度>pET-TRSTER>TrxR-ΔC(P<0.05)。見表1。

表1 3種蛋白活性的吸光度比較(n=3)

2.5 金諾芬對(duì)3種蛋白的活性抑制效果 結(jié)果顯示，TrxR和pET-TRSTER當(dāng)抑制劑濃度>0.0049 μmol/mL時(shí)蛋白的抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在0.0049 μmol/mL之后蛋白活性抑制率均低于0.019 50～5.000 00濃度(P<0.05)；0.000 004 77～0.001 221抑制劑濃度的蛋白活性低于0.0049濃度(P<0.05)；0.000 004 77～0.000 305抑制劑濃度的蛋白活性低于0.001 221濃度(P<0.05)；0.000 004 77～0.000 076 3抑制劑濃度的蛋白活性低于0.000 305濃度(P<0.05)，但0.000 004 77～0.000 076 3濃度之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TrxR-ΔC蛋白在抑制劑濃度0.000 004 77 μmol/mL的活性低于其他10個(gè)濃度(P<0.05)；0.000 019 1抑制劑濃度的蛋白活性低于5.000 00濃度(P<0.05)；其他不同抑制劑濃度的蛋白活性之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 金諾芬對(duì)3種蛋白的活性抑制效果(n=3)

3 討論

癌癥在我國(guó)已成為人們十分關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。隨著人口老齡化的逐步加劇，癌癥帶來的社會(huì)負(fù)擔(dān)也在逐步加重[2]，腫瘤防治已成為社會(huì)發(fā)展不得不面對(duì)的重要問題。

腫瘤細(xì)胞因代謝紊亂而導(dǎo)致內(nèi)源性活性氧水平升高[3]。增加的活性氧水平可能與腫瘤細(xì)胞的氧化還原能力增強(qiáng)和腫瘤抑制功能的喪失有關(guān)[4-5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，活性氧在腫瘤的長(zhǎng)期進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，它通過調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的增殖，導(dǎo)致癌癥惡化[6]。腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)氧化還原通路的方式逃避由活性氧升高而產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用，以此來維持細(xì)胞活性[7]。

硫氧還蛋白(Trx)系統(tǒng)是細(xì)胞主要的氧化還原系統(tǒng)之一。硫氧還蛋白還原酶(TrxR)作為一種重要的ROS清除酶，保護(hù)癌細(xì)胞免受大量ROS引起的細(xì)胞凋亡[8]。硫氧還蛋白(Trx)的家族有三種酶：硫氧還蛋白(Trx)、硫氧還蛋白還原酶(TrxR)以及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，它們是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控的重要組成部分[9]。TrxR在細(xì)胞中廣泛表達(dá)[10]，根據(jù)分布區(qū)域的不同而被分為3種同工酶[11]。最早發(fā)現(xiàn)的是TrxR1，也是目前為止研究最多的一種同工酶。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞中TrxR1呈高表達(dá)狀態(tài)，且是腫瘤細(xì)胞維持細(xì)胞活性不可或缺的酶[12-13]。在哺乳動(dòng)物中硫氧還蛋白還原酶(TrxR)的碳末端倒數(shù)第二位具有一個(gè)活性尾巴——硒半胱氨酸(Sec)的含硒氨基酸[14]。大量研究表明，具有活性的突出于酶表面的碳端C尾，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

由于誘導(dǎo)溫度和時(shí)間是原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因效率的重要影響因素[15]，本實(shí)驗(yàn)通過摸索誘導(dǎo)溫度和時(shí)間來提高目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。純化出的目的蛋白可溶性良好，表達(dá)效率較高。蛋白活性檢測(cè)表明其純化且蛋白活性較好。TrxR活性抑制實(shí)驗(yàn)表明C端含硒半胱氨酸是TrxR蛋白發(fā)揮活性的必須氨基酸。

綜上所述，C端含硒半胱氨酸是TrxR發(fā)揮蛋白活性不可或缺的部分。同時(shí)應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)以低廉高效的方式純化出比天然TrxR蛋白活性更好的TrxR重組蛋白，為后續(xù)TrxR蛋白抑制藥物的廣譜篩選提供了一定的基礎(chǔ)。