馬慧敏，于 猛，黃后寶，李亞偉，張 鵬，黃建軍，程 龍，馮 鋼

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科；2.泌尿外科,安徽 蕪湖 241001)

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是腎癌中最常見的病理學(xué)類型，其發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)不斷上升。手術(shù)切除是目前治療腎透明細(xì)胞癌的主要方式，但約30%的患者在術(shù)后可出現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[1-2]。近年來，分子靶向藥物開始逐步應(yīng)用于腎癌的臨床治療，極大的提高了患者的生存，但晚期ccRCC患者的預(yù)后依然較差。因此，尋找有效的腎癌分子標(biāo)志物對(duì)于腎癌的早期診斷、預(yù)后判斷等具有重要的臨床意義。

脊椎蛋白2(SPON2)是一種細(xì)胞外基質(zhì)分泌蛋白，在獲得性免疫和先天性免疫中發(fā)揮著重要作用，可募集炎性細(xì)胞和促進(jìn)神經(jīng)元生長。近年來多項(xiàng)研究表明，在肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌和肺腺癌中，SPON2的表達(dá)與患者預(yù)后存在顯著相關(guān)[3-6]。但是SPON2在ccRCC中的表達(dá)及其功能，目前尚未見報(bào)道。本研究通過檢測ccRCC中SPON2基因的表達(dá)情況，分析其與ccRCC患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，并采用體外實(shí)驗(yàn)研究SPON2在ccRCC中的生物學(xué)功能，旨在闡明SPON2在ccRCC中的臨床意義及其功能。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 本研究收集2018年1月～2019年7月弋磯山醫(yī)院114例ccRCC患者腫瘤組織及其癌旁組織標(biāo)本，其中男性66例，女性48例，年齡28～83歲。所有患者術(shù)前均未接受過輔助治療。原位ccRCC定義為初次評(píng)估時(shí)無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤分期按2010年AJCC的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，病理分級(jí)按Fuhrman分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。本研究已獲得參與者的知情同意。

1.1.2 細(xì)胞株 人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2細(xì)胞)和人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株(786-0細(xì)胞，Caki-1細(xì)胞)均購自于北京北納科技有限公司。

1.1.3 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、PPMI-1640培養(yǎng)基、McCoys 5A培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液、Marker、ECL顯色試劑盒(Beyotine)，Lipofectamine 2000(invitrogen)，SPON2抗體、β-actin抗體(Abcam)，Trizol Universal、mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，xCELLigence 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀、E-Plate板(ACEA)，凋亡檢測試劑(北京貝博生物公司)，逆轉(zhuǎn)錄儀、熒光定量PCR儀、垂直電泳儀(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 取各例腫瘤組織石蠟標(biāo)本切片(4 μm)，按脫蠟水化、抗原修復(fù)、去內(nèi)源性酶、抗原封閉、SPON2一抗、二抗孵育、發(fā)色、蘇木精復(fù)染、脫水、封片、鏡檢、結(jié)果判定進(jìn)行免疫組化染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察，染色為棕黃色或棕褐色的為SPON2陽性。

1.2.2 細(xì)胞總蛋白的提取和Western Blot 細(xì)胞裂解、蛋白濃度定量后，SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，SPON2一抗封膜并孵育過夜，二抗洗膜，加入顯影液，采用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶顯影情況。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和RT-PCR 采用Lipofectamine 2000試劑盒進(jìn)行細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染。TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA后，qPCR擴(kuò)增檢測。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算SPON2的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 增殖實(shí)驗(yàn)和凋亡實(shí)驗(yàn) 向E-Plate板中加入50 μL McCoy′s5A培養(yǎng)基，RTCA分析儀(置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中)設(shè)置基線，于E-Plate 板中加入100 μL(6×103)細(xì)胞懸液，室溫放置30 min，置于RTCA分析儀中，實(shí)時(shí)監(jiān)測3 d。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化，計(jì)數(shù),接種于6孔培養(yǎng)板上,每孔接種500細(xì)胞,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色15 min，鏡下拍照計(jì)數(shù)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化細(xì)胞，PBS洗2遍，50 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，上述細(xì)胞懸液中分別加入Annexin-FITC和PI 染液各5 μL，混勻，避光孵育15 min，加1×PBS 250 μL，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，用滅菌的100 μL槍頭在培養(yǎng)板中垂直均勻劃線，PBS清洗脫落的細(xì)胞3次，每孔加入2 mL無血清培養(yǎng)液，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、24 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察并拍照。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化，用無血清的McCoy′s5A培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液，每孔加入Matrigel 50 μL鋪膠于Transwell膜小室，置于37℃ 30min。取制備的細(xì)胞懸液200 μL(5×103)加入Transwell小室上室，下室加入含10%FBS的McCoy′s5A培養(yǎng)基500μL，置于37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，PBS適當(dāng)清洗，4%多聚甲醛固定30 min，風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS清洗，選取5個(gè)視野直接鏡下拍照觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 SPON2在ccRCC中表達(dá)增高 ccRCC癌組織中SPON2蛋白陽性表達(dá)率(60.53%)高于癌旁組織(36.84%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.798，P=0.000)；ccRCC癌組織中mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織(t=23.293，P=0.000)(見表1)。免疫組化顯示，SPON2主要分布于胞質(zhì)中，染色為棕黃色或棕褐色的為SPON2陽性表達(dá)(圖1A)。SPON2 mRNA在Caki-1細(xì)胞中的表達(dá)高于HK-2細(xì)胞(P<0.05)，但HK-2細(xì)胞和786-0細(xì)胞中SPON2 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。Western Blot實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了上述結(jié)果(圖1B)，因此采用Caki-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的功能研究。siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Caki-1細(xì)胞24 h后，SPON2的表達(dá)降低，表明轉(zhuǎn)染成功，其中siRNA1-SPON2的敲除效果最顯著(圖1C)。

A.免疫組化；B.SPON2在3株細(xì)胞中的蛋白表達(dá)；C.Caki-1細(xì)胞株中SPON2干擾后的蛋白表達(dá)。

表1 SPON2在ccRCC組織及癌旁組織的表達(dá)

表2 SPON2在ccRCC細(xì)胞株中的表達(dá)

2.2 SPON2與ccRCC患者臨床病理資料的關(guān)系 如表3所示，SPON2 mRNA表達(dá)水平和SPON2蛋白表達(dá)水平均和ccRCC患者的年齡、性別、組織壞死相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與ccRCC患者的腫瘤直徑、TNM分期、Fuhrman分級(jí)、肉瘤樣改變、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移均存在相關(guān)性(P<0.05)。

表3 SPON2與ccRCC患者臨床病理資料的關(guān)系

2.3 SPON2敲減可抑制ccRCC細(xì)胞的遷移和侵襲 RTCA增殖實(shí)驗(yàn)顯示，siRNA-SPON2組和對(duì)照組的生長曲線基本一致(圖2A)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示，siRNA-SPON2組細(xì)胞克隆數(shù)(0.92±0.17)和對(duì)照組(1.00±0.00)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.833，P=0.493，見圖2B)。siRNA-SPON2組細(xì)胞總凋亡率(0.77±0.21)%與對(duì)照組(0.90±0.30)%差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.632，P=0.561)，見圖2C。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，siRNA-SPON2組的細(xì)胞傷口愈合率(31.00±3.60)%低于對(duì)照組(92.33±4.04)%(t=19.614，P=0.000，見圖2D)。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA-SPON2組的細(xì)胞侵襲數(shù)(0.48±0.08)與對(duì)照組相比(1.00±0.00)減少(t=11.717，P=0.007，見圖2E)。

A.RTCA增殖實(shí)驗(yàn);B.克隆形成實(shí)驗(yàn);C.凋亡分析;D.劃痕實(shí)驗(yàn);E.侵襲實(shí)驗(yàn)。

3 討論

作為一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，SPON2具有募集炎癥細(xì)胞、激活固有免疫應(yīng)答等多種功能。近年來，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)SPON2存在高表達(dá)，包括肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌[7-9]。本研究采用免疫組化和RT-PCR檢測了114例ccRCC患者樣本中SPON2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SPON2蛋白和mRNA在ccRCC中的表達(dá)水平均高于癌旁組織，并且還發(fā)現(xiàn)SPON2的表達(dá)和腫瘤直徑、腫瘤的臨床分期和病理分級(jí)明顯相關(guān)，提示SPON2的高表達(dá)可能與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)。肉瘤樣改變被認(rèn)為是高侵襲性ccRCC的一個(gè)特征。我們發(fā)現(xiàn)SPON2在伴肉瘤樣改變的ccRCC中表達(dá)水平高于無肉瘤樣改變的ccRCC。此外，在ccRCC轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中，SPON2的表達(dá)升高，提示SPON2與ccRCC的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)Caki-1細(xì)胞中SPON2 mRNA和蛋白水平均高于786-0、HK-2細(xì)胞。但在786-0和HK-2細(xì)胞之間未發(fā)現(xiàn)上述差異。此外，敲除SPON2未能顯著改變Caki-1細(xì)胞的體外增殖、集落形成和細(xì)胞凋亡，此結(jié)果不同于既往的報(bào)道[4,9]。我們推測SPON2在不同類型腫瘤中的功能存在差異。在本研究中，SPON2高表達(dá)與ccRCC轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，敲除SPON2可明顯降低Caki-1細(xì)胞的侵襲和遷移能力。然而，Zhang等[7]的研究顯示，過表達(dá)SPON2可抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。因此SPON2在腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移中的作用是復(fù)雜的，需要進(jìn)一步的研究。

作為一項(xiàng)回顧性觀察研究，納入的患者數(shù)量相對(duì)較少，我們的結(jié)果可能不具有充分的代表性。SPON2在ccRCC中確切的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。綜上所述，SPON2在ccRCC中表達(dá)增高，且與腫瘤直徑、腫瘤分期、Fuhrman分級(jí)、肉瘤樣改變和轉(zhuǎn)移相關(guān)。敲除SPON2能夠抑制ccRCC細(xì)胞的侵襲和遷移能力。