邵 躍 斌

(廣州市紅十字會醫(yī)院醫(yī)務(wù)科 廣州 510220)

帕金森病 (Parkinson's disease，PD)是一種是常見于中老年人的進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，其臨床表現(xiàn)與中醫(yī)學中“顫證”、“痙病”等病證的描述相似。杞菊地黃丸是治療肝腎陰虧的經(jīng)典方劑，陽陵泉是治療筋病的要穴，兩者聯(lián)合應(yīng)用治療帕金森病收到了良好的療效，但其神經(jīng)保護機制尚未明確。本課題通過復(fù)制帕金森大鼠模型，探討杞菊地黃丸配合針刺陽陵泉對帕金森病的防治作用及可能的神經(jīng)保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥物

6～8周齡SPF級SD大鼠，體重(200±20)g，由廣東省實驗動物中心提供。

杞菊地黃丸配方：枸杞子、菊花、熟地黃、 酒萸肉、 牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉。 6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)： 美國Sigma 公司產(chǎn)品； 阿樸嗎啡(apomorphine，APO)：美國Sigma 公司產(chǎn)品。

1.2 帕金森動物模型制作

10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后固定于立體定位儀上，頭部備皮消毒，沿正中矢狀線切開顱頂皮膚，剝離骨膜，暴露前囟。確定右側(cè)黑質(zhì)二坐標：(1)前囟后5.2mm，正中線右側(cè)1.0mm，硬膜下9.0mm；(2)前囟后5.2mm，正中線右側(cè)2.5mm，硬膜下8.5mm。用微量注射器以1μl/min速度分別向每點注射6-OHDA(溶于含0.2%維生素C的生理鹽水中，濃度為2μg/μl)3μl，注射完畢后留針5min, 而后以1.0mm/min速度緩慢退針；縫合頭皮，腹腔注射慶大霉素，待大鼠清醒后放回籠內(nèi)飼養(yǎng)；10d后，腹腔注射APO 0.5mg/kg 誘發(fā)大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄開始旋轉(zhuǎn)至30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，以每分鐘旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均超過7次者為合格的帕金森模型。

1.3 實驗動物分組及給藥

將造模成功的30只PD大鼠隨機分為模型組、左旋多巴陽性對照組和中醫(yī)綜合治療組，每組10只，另納入10只正常SD大鼠作為正常對照組。左旋多巴陽性對照組給予腹腔注射左旋多巴40mg/kg, 中醫(yī)綜合治療組給予每天灌胃2g生藥/kg并針刺陽陵泉穴，連續(xù)給藥4周。模型組和正常組用等量生理鹽水灌胃。

1.4 SOD活性及GSH含量的檢測

實驗動物處死后，分離左側(cè)紋狀體及黑質(zhì)組織，加入生理鹽水冰浴勻漿，收集勻漿液4℃ 5000r/min 離心15min后，取上清液。取適量上清液進行SOD活性、GSH含量的檢測，具體方法按碧云天公司試劑盒說明書步驟進行測試。

1.5 Western Blot檢測BDNF表達

左側(cè)紋狀體及黑質(zhì)組織鹽水冰浴勻漿后，用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白(碧云天，中國)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，中國)測定蛋白濃度。經(jīng)12% SDS/PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)膜，用TBST配制的含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2h后加一抗4℃孵育過夜：GAPDH抗體(Abcam，美國)、 BDNF抗體(Abcam，美國)。次日洗膜，室溫孵育相應(yīng)HRP標記的二抗1h，ECL化學發(fā)光法檢測相關(guān)蛋白表達。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值作為蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 杞菊地黃丸配合針刺陽陵泉對PD大鼠GSH、SOD的影響

模型組與正常對照組比較，GSH、SOD 明顯降低，左旋多巴陽性對照組GSH、SOD水平均較模型組有明顯升高，而中醫(yī)綜合治療組中GSH、SOD水平均較模型組也有所升高，差異均有顯著意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 GSH(A)、SOD(B)水平檢測(*P<0.05)

2.2 杞菊地黃丸配合針刺陽陵泉對PD大鼠BDNF表達的影響

模型組與正常對照組比較，BDNF表達明顯降低，左旋多巴陽性對照組與模型組比較，BDNF表達明顯升高，而中醫(yī)綜合治療組中BDNF表達與模型組比較也有所升高，差異均有顯著意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 BDNF蛋白表達檢測(*P<0.05)

3 討論

帕金森病的病理基礎(chǔ)是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元慢性進行性退變、壞死。許多學者認為氧化應(yīng)激是黑質(zhì)DA能神經(jīng)元選擇性損傷的關(guān)鍵因素[2～3]。GSH 系統(tǒng)是腦組織內(nèi)最重要的抗氧化系統(tǒng)[4], PD患者黑質(zhì)中GSH減少，加劇了自由基損害[5]；SOD能清除O2-，其活力的高低間接反應(yīng)了機體清除自由基的能力。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中對神經(jīng)元的生存分化、生長起重要作用，且已經(jīng)被證明在體內(nèi)外均可促進中腦多巴胺神經(jīng)元的生存和分化[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，PD模型組GSH、SOD表達明顯低于正常對照組，BDNF表達量也明顯降低，在左旋多巴陽性對照組中各指標均有回升，與文獻報道一致。本研究結(jié)果顯示，杞菊地黃丸配合針刺陽陵泉治療后，PD大鼠的GSH、SOD表達量明顯高于模型組，BDNF表達也有所升高，差異有顯著意義(P<0.05)，表明杞菊地黃丸配合針刺陽陵泉治療能夠改善PD大鼠紋狀體勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)以及黑質(zhì)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達，提示其抗氧化作用及神經(jīng)保護作用。

帕金森病的臨床表現(xiàn)與中醫(yī)學中“顫證“、“痙病”等病證的描述相似，對于其發(fā)病機制現(xiàn)在還存在一定爭議，而肝腎虧虛是各學者都一致認同的發(fā)病基礎(chǔ)[7]。而且，在臨床的辨證分型中，陰虛內(nèi)動型也是最為常見的證型[8]。

杞菊地黃丸源于滋陰的代表方六味地黃丸，同時添加菊花、枸杞所成。方中主藥熟地能甘柔補血，滋腎填精，澤瀉可宣泄腎濁，丹皮清瀉肝火，山萸肉澀精固脫，茯苓滲脾利濕，山藥收斂脾經(jīng)，菊花清肝明目，枸杞養(yǎng)肝滋腎，諸藥共同作用，實現(xiàn)滋腎養(yǎng)肝之功效，能夠改善肝腎陰虧的諸多癥狀。陽陵泉是治療筋病的要穴，臨床較為常用，具有舒筋和壯筋的作用。近年來通過針刺陽陵泉治療痙攣性偏癱、運動功能障礙、神經(jīng)麻痹等疾病的報道屢見不鮮[9～10]，也是針刺治療帕金森病的最常用穴位之一[11]。我們在臨床中采用杞菊地黃丸配合針刺陽陵泉治療帕金森病，收到了改善臨床癥狀、提高患者生活質(zhì)量、延緩疾病發(fā)展的效果，且此方法操作簡單易行，患者依從性強，有利于臨床推廣。

本研究借助PD大鼠模型，給予杞菊地黃丸灌胃和針刺陽陵泉，并檢測PD大鼠的紋狀體勻漿上清液中SOD活性、GSH含量，及黑質(zhì)組織BDNF表達變化，證明杞菊地黃丸配合針刺陽陵泉對帕金森大鼠有抗氧化防治作用及神經(jīng)保護作用，為臨床推廣應(yīng)用提供了依據(jù)。