劉 雪,馮曉佳,張振偉,錢 軍

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:Qianjun215036@sina.com)

目前我國國內(nèi)胃癌(gastric cancer)的發(fā)病率和病死率分居惡性腫瘤的前列,晚期GC的5年生存率更是不到5%[1]。為了降低GC發(fā)病率,有必要深入了解GC細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)制。

類端粒沉默干擾體-1(disruptor of telomeric silencing-1,DOT1)是一種在哺乳動(dòng)物進(jìn)化過程中發(fā)揮作用的保守蛋白,其在人類基因中被稱為DOT1L(disruptor of telomeric silencing-1-like),是組蛋白H3第79位賴氨酸的特異性甲基轉(zhuǎn)移酶[2]。根據(jù)最近報(bào)道,DOT1L介導(dǎo)的H3K79甲基化是可逆的,并且對基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞生物學(xué)活性、胚胎的健康發(fā)育均發(fā)揮重要的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn),在卵巢癌中DOT1L通過調(diào)控SPARC的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲、黏附和血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性[4]。在乳腺癌中DOT1L基因的過表達(dá),導(dǎo)致乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力發(fā)生改變,并激發(fā)體內(nèi)腫瘤干細(xì)胞微球體形成[5,6]。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)[7]是細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,此類蛋白可通過細(xì)胞信號通路誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生增殖、分化等一系列細(xì)胞生理活動(dòng)[8]。

本課題組前期利用TCGA數(shù)據(jù)庫中公開的數(shù)據(jù)來探討GC患者中DOT1L的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)性[9]。通過對DEGs進(jìn)行KEGG PATHWAY和GSEA富集分析預(yù)測增殖信號通路[10,11]。通過分析的結(jié)果表明:DOT1L表達(dá)水平升高與胃癌的增殖和較差的患者預(yù)后之間存在直接的聯(lián)系,因此本課題組觀察DOT1L在胃癌組織中調(diào)控癌細(xì)胞的增殖能力,并探討其作用機(jī)制,為胃癌的臨床治療提供可能的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

胃癌細(xì)胞株MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45、AGS均由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。胎牛血清采購自杭州四季青生物工程材料有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、1%青霉素-鏈霉素混合物均購自美國Gibc公司;real-time PCR試劑盒購自美國Promega公司;TRIzoI試劑購自美國Invitrogen公司;Primescript RT試劑購自日本TaKaRa公司;CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、0.1%結(jié)晶紫均購自上海碧云天公司;poly-brene,嗓吟霉素、胰酶均購自美國Sigma公司;DOT1 L、ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38MAPK標(biāo)識基因蛋白一抗(鼠抗)均購自美國ABclonal公司;β-actin一抗(鼠抗)、DOT1L、ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38MAPK標(biāo)識基因蛋白、β-actin二抗(羊抗鼠)均購自美國Abbkine公司;DOT1L基因沉默組慢病毒顆粒(pLKO.1 puro-DOT1L-shRNA)及陰性對照組慢病毒顆粒(pLKO.1puro-shNC),DOT1L過表達(dá)慢病毒(pLKO.1puro-DOT1L)均由吉瑪公司構(gòu)建。

DOT1L基因沉默組慢病毒顆粒序列為:CCGGG-CCCGCAAGAAGAAGCTAAACCTCGAGGTTTAGCTT-CTTCTTGCGGGCTTTTTG,陰性對照組慢病毒顆粒序列:CCGGCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCG-AGGGCGACTTAACCTTAGGTTTTTG。

本實(shí)驗(yàn)DOT1L及β-actin上下游引物序列的設(shè)計(jì)任務(wù)均由上海生物公司完成。DOT1L上游引物:5′-CATCACTATGGCGTCGAGAAA-3′,下游引物:5′-CGCCTCTCTCCAATGTGTATT-3′;β-actin上游引物:5′-CAGGAAGGA AGGCTGGAAG-3′,下游引物:5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′。

1.2 Western blotting法檢測5種不同胃癌細(xì)胞株DOT1L蛋白表達(dá)水平

將空白組中MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45和AGS五種細(xì)胞株離心后取細(xì)胞沉淀。采用RIPA法裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取等體積5組蛋白樣品組上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后經(jīng)5%脫脂牛奶封閉非特異性位點(diǎn)2 h后,轉(zhuǎn)移至孵育盒中,DOT1L(1 ∶1 000)抗體稀釋和β-actin(1 ∶1 000)稀釋并4 ℃孵育過夜。次日洗膜3次后,每次15 min加入二抗(1 ∶3 000)室溫?fù)u床孵育2 h,洗膜3次,每次10 min經(jīng)暗室顯色顯影后,使用Image J軟件圖像分析,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算出各組細(xì)胞中DOT1L基因蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 選取MGC-803、SGC-7901胃癌細(xì)胞系進(jìn)行病毒感染

將胃癌MGC-803、SGC-7901細(xì)胞均勻接種于6孔板中,每孔約種5×105個(gè)細(xì)胞,稀釋polybrene終濃度為5 μg/ml。轉(zhuǎn)染步驟操嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)分為NC組(轉(zhuǎn)染pLKO.1puro-shNC)、shDOT1L組(只轉(zhuǎn)染pLKO.1puro-DOT1L-shRNA)和oe-DOT1L組(shDOT1L組穩(wěn)轉(zhuǎn)后轉(zhuǎn)染過表達(dá)慢病毒pLKO.1puro-DOT1L),挽救實(shí)驗(yàn)用2 μg/ml的嘌吟霉素對MGC-803、SGC-7901胃癌細(xì)胞進(jìn)行篩選,收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4 RNA提取與實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測轉(zhuǎn)染效果

分別提取shDOT1L組、NC組胃癌細(xì)胞株總RNA,Primescript RT試劑逆轉(zhuǎn)錄RNA成cDNA。運(yùn)用RT-PCR系統(tǒng),用SYBR Green RT-PCR試劑盒顯色,qRT-PCR分析mRNA水平。反應(yīng)總體系為20 μl,一切操作均參考試劑說明書,每個(gè)樣品為3個(gè)復(fù)孔(β-actin作為內(nèi)參,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。各組Ct值與β-actin的Ct值相減得到ΔCt,用2-ΔΔCt方法比較。

1.5 Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染效果

按1.2項(xiàng)步驟,檢測MGC-803、SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒后,DOT1L蛋白的表達(dá)水平。

1.6 細(xì)胞增殖能力的檢測

1.6.1 細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 將MGC-803、SGC-7901胃癌細(xì)胞株接種在6孔板中(1 000/孔)。培養(yǎng)至細(xì)胞集落后,用70%乙醇固定結(jié)晶紫染色。顯微鏡40倍鏡下觀察拍照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 消化MGC-803、SGC-7901胃癌細(xì)胞株后,接種于96孔板(5 000/孔),將CCK-8溶液分別在1,2,3,4,5 d加入各孔中,37 ℃孵育2 h后。在波長450 nm下檢測shDOT1L組、NC組和oe-DOT1L組GC細(xì)胞吸光度值,繪制增殖曲線圖,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blotting法檢測MAPK通路相關(guān)調(diào)控蛋白及Ki-67蛋白表達(dá)水平

按1.2項(xiàng)步驟分別檢測shDOT1L組、NC組和oe-DOT1L組中GC細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Erk)、磷酸化Erk(Erk-p)、38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)及Ki-67蛋白表達(dá)水平。

1.8 TCGA數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析

1.8.1 RNA-seq-based數(shù)據(jù)分析 使用TCGA數(shù)據(jù)庫下載了375例GC患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)類型:HTSeq-Counts)和相關(guān)臨床信息。利用R語言篩選癌組織與正常組織差異表達(dá)超過1倍的基因。然后對375例非配對樣本和32對癌旁組織配對(以降低個(gè)體差異對基因表達(dá)的影響)樣本,進(jìn)行Wilcox檢驗(yàn)分析DOT1L表達(dá)的差異。用DOT1L的中間值作為cut-off值,通過Kaplan-Meier分析評估高低兩組DOT1L與總生存率之間的相關(guān)性,并用ROC分析其特異性和敏感性,我們將HTSeq-FPKM數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為TPM(百萬讀記錄)格式,以方便下游分析。下游分析中使用了總共375個(gè)GC患者的TPM值,而不可用的臨床數(shù)據(jù)被認(rèn)為是缺失值。

1.8.2 GO注釋和KEGG分析 用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行GO注釋后,KEGG pathway預(yù)測參與胃癌發(fā)展過程中的關(guān)鍵通路。

1.8.3 GSEA富集分析 首先我們利用GSEA方法根據(jù)表達(dá)數(shù)據(jù)集文件及表型數(shù)據(jù)文件合成了一份基因列表,并根據(jù)樣本中DOT1L的中位值作為cutoff值,將患者數(shù)據(jù)集分為DOT1L高表達(dá)組和低表達(dá)組。每次分析共進(jìn)行1 000個(gè)基因組排列。富集差異顯著(FDR<0.05,NOMP<0.05)進(jìn)行識別和分類。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GC患者中DOT1L mRNA的表達(dá)水平

與癌旁組織比較,DOT1L mRNA在GC組中的表達(dá)顯著增加(1.26倍,P<0.05,見圖1A)。此外,與配對的癌旁組織比較,同樣驗(yàn)證了GC樣本中DOT1L mRNA水平明顯升高(1.75倍,P<0.05,見圖1B)。

圖1 GC組織中DOT1L mRNA的表達(dá)量Figure 1 DOT1L mRNA expression in gastric cancer tissues

2.2 DOT1L基因的表達(dá)與GC患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線顯示:與低表達(dá)組相比,DOT1L高表達(dá)組OS顯著降低(P<0.05,見圖2A)。ROC曲線結(jié)果顯示:DOT1L基因的AUC值為73.3%(見圖2B)。

圖2 DOT1L基因的表達(dá)與GC患者預(yù)后的關(guān)系Figure 2 Relationship of DOT1L expression with the overall survival rate

2.3 DOT1L蛋白在GC細(xì)胞系中的表達(dá)水平

Western blotting結(jié)果顯示,DOT1L蛋白在AGS細(xì)胞相對表達(dá)量0.122±0.015,MKN-45細(xì)胞相對表達(dá)量0.284±0.015,BGC-823細(xì)胞相對表達(dá)量0.371±0.011,SGC-7901細(xì)胞相對表達(dá)量為0.542±0.031,MGC-803細(xì)胞相對表達(dá)量0.582±0.004,其中SGC-7901、MGC-803癌株的DOT1L蛋白表達(dá)最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖3),本研究擬選用這兩株進(jìn)行本研究的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 real-time PCR和Western blotting分別檢測shDOT1L組轉(zhuǎn)染效率

與對照組比較,shDOT1L組癌株mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=63.100,P<0.05;F=59.230,P<0.05,見圖4A)。shDOT1L組癌株DOT1L蛋白表達(dá)水平較對照組明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=71.310,P<0.05;F=95.800,P<0.05,見圖4B)。沉默的效果與上述mRNA表現(xiàn)一致,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與AGS組比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 各組癌株中DOT1L蛋白表達(dá)水平Figure 3 Expression level of DOT1L protein in gastric cancer cells

2.5 細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn)和CCK-8法檢測癌株增殖能力

與對照組相比,shDOT1L組SGC-7901和MGC-803克隆增殖形成能力明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.920,P<0.05;F=28.230,P<0.05,見圖5);CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比,shDOT1L組GC細(xì)胞在2,3,4,5 d觀察OD450值明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.440,P<0.05;F=36.624,P<0.05,F=38.451,P<0.05;F=35.524,P<0.05,見圖5)。以上結(jié)果表明DOT1L降低可以抑制GC細(xì)胞的增殖能力。

與對照組或NC組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 沉默DOT1L后兩組DOT1L轉(zhuǎn)染效率Figure 4 Transfection efficiency of DOT1L in two groups

與相應(yīng)的NC組比較,*P<0.05,**P<0.01圖5 沉默DOT1L基因?qū)C增殖能力的影響Figure 5 Effect of DOT1L gene silencing on the proliferation of GC

2.6 富集分析DOT1L調(diào)控胃癌增殖潛在的通路

根據(jù)KEGG PATHWAY富集分析結(jié)果提示DOT1L主要參與的增殖通路有:MAPK通路(見圖6A)。GSEA基因集富集分結(jié)果顯示:DOT1L高表達(dá)時(shí)腫瘤細(xì)胞在KEGG-MAPK-SIGNALING-PATHWAY通路明顯富集(P-value<0.05),此結(jié)果與KEGG pathway富集分析的結(jié)果一致(見圖6B)。

圖6 基因DOT1L的通路富集分析結(jié)果Figure 6 Pathway enrichment analysis of DOT1L gene

2.7 Western blotting檢測MAPK-SIGNALING-PATHWAY通路調(diào)控蛋白

SGC-7901和MGC-803中,與對照組比較,shDOT1L組的Erk-p、p-p38MAPK明顯升高,而Ki-67顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);通過挽救實(shí)驗(yàn),與shDOT1L組比較,oe-DOT1L組Erk-p、p-p38MAPK明顯降低,而Ki-67恢復(fù)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖7),說明DOT1L基因調(diào)控MAPK信號通路。

與NC組比較,*P<0.05,**P<0.01圖7 Western blotting檢測兩組GC細(xì)胞MAPK信號通路相關(guān)蛋白及Ki-67蛋白表達(dá)水平Figure 7 Expression levels of proteins related to MAPK signaling pathway and Ki67 protein in two GC cells by Western blotting

2.8 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測挽救實(shí)驗(yàn)GC細(xì)胞增殖能力

與shDOT1L組比較,oe-DOT1L組在2,3,4,5 d觀察OD450值明顯回升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.140,P<0.05;F=30.47,P<0.05;F=35.401,P<0.05;F=38.524,P<0.05,見圖8)。提示過表達(dá)DOT1L消除了DOT1L抑制GC細(xì)胞增殖的作用,這與蛋白印跡檢測結(jié)果Ki-67表現(xiàn)一致。

與shDOT1L組比較,*P<0.05,**P<0.01圖8 CCK-8測定過表達(dá)DOT1L基因?qū)C增殖能力的影響Figure 8 Effect of DOT1L overexpression on the proliferation of GC by CCK-8

3 討論

DOT1L作為人體內(nèi)賴氨酸的甲基轉(zhuǎn)移修飾酶,其是H3K79特異性的甲基化轉(zhuǎn)移酶,與多種癌癥有關(guān),并與腫瘤細(xì)胞侵襲和增殖相關(guān)[12]。Okada有研究發(fā)現(xiàn)乳腺疾病中,DOT1L基因與乳腺惡性腫瘤病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),DOT1L基因過表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展,臨床實(shí)驗(yàn)DOT1L基因靶向抑制劑EPZ5676能夠使癌細(xì)胞的生物學(xué)活性發(fā)生改變[13]。在白血病(MLL)中,DOT1L能夠調(diào)控機(jī)體免疫細(xì)胞活性,提高抗腫瘤能力[14]。最近的一些報(bào)道認(rèn)為DOT1L基因高表達(dá)在前列腺癌、直腸癌及食管癌中可能發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用,DOT1L基因可作為潛在的治療靶點(diǎn)[15,16]。然而,目前DOT1L基因?qū)ξ赴┑脑鲋硻C(jī)制,尚無相關(guān)報(bào)道。

本研究利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)DOT1L在GC組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織,并且DOT1L高表達(dá)組患者的總生存率明顯降低。對DEGs進(jìn)行集富集分析,預(yù)測到MAPK增殖信號通路。為了驗(yàn)證此預(yù)測結(jié)果,進(jìn)一步進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。shDOT1L組的癌株細(xì)胞mRNA、蛋白表達(dá)量和增殖能力較對照組顯著降低,說明抑制DOT1L基因的表達(dá)可以抑制GC的增殖能力。檢測MAPK信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白,shDOT1L組中Erk-p、p-p38MAPK表達(dá)水平升高,提示DOT1L基因調(diào)控MAPK信號通路;為了進(jìn)一步求證進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn),oe-DOT1L組中Erk-p、p-p38MAPK明顯又降低,結(jié)果證實(shí)了DOT1L基因在MAPK信號通路中起到關(guān)鍵作用。通過CCK-8法檢測表明,與shDOT1L組比較,oe-DOT1L組細(xì)胞增殖能力明顯恢復(fù),說明過表達(dá)DOT1L消除了DOT1L基因抑制GC細(xì)胞增殖的作用。細(xì)胞增殖指數(shù)Ki-67在shDOT1L組顯著降低，在oe-DOT1L組恢復(fù)升高，進(jìn)一步說明了DOT1L在GC細(xì)胞的增殖過程中起到關(guān)鍵作用。綜上所述,MAPK號通路可能在DOT1L介導(dǎo)的GC增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用,證實(shí)了DOT1L通過MAPK通路調(diào)控GC細(xì)胞增殖的機(jī)制。

可逆蛋白磷酸化是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最重要的生物學(xué)機(jī)制之一,它受到蛋白激酶和磷酸酶的嚴(yán)格調(diào)控,維持蛋白磷酸化狀態(tài)的平衡,控制其生物學(xué)功能。MAPK通路在人類癌癥中被頻繁激活,引發(fā)自發(fā)性細(xì)胞增殖等惡性表型出現(xiàn),這與之前的研究一致。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶Erk是MAPK通路中的重要成員之一,可將細(xì)胞外信號傳遞至細(xì)胞內(nèi),激活多種癌基因的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化及惡性轉(zhuǎn)化等過程[17]。p38 MAPK可通過多個(gè)底物(如磷酸化轉(zhuǎn)錄因子、與細(xì)胞骨架相關(guān)的細(xì)胞和酶等)來調(diào)控細(xì)胞的多種生理過程(如細(xì)胞凋亡、癌基因轉(zhuǎn)化和細(xì)胞增殖、分化等)[18]。

本研究認(rèn)為,在GC患者中靶向阻斷DOT1L基因,可通過MAPK信號通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力。DOT1L可以作為胃癌治療的新靶點(diǎn),在臨床上可能給胃癌的治療提供新的思路。MAPK信號通路是復(fù)雜的多步驟過程,本研究僅對其中Erk、p38MAPK蛋白進(jìn)行了研究,且由于只有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果,存在一定的局限性,是否存在其他調(diào)控的增殖通路,還需要對其進(jìn)行更深入的探索與研究。