張新鑫,朱夢(mèng)琪,王 輝,韓亞娟,賈建光*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科,蚌埠 233000;2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:jiajianguang1978@126.com)

胃癌是全球最常見的癌癥之一,其在癌癥中具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。僅在2018年,美國大約就有26 420例新發(fā)胃癌病例和10 800例胃癌死亡病例[2]。在中國的癌癥患者中,消化道腫瘤仍然是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因[3]。胃癌早期患者通常有很高的康復(fù)機(jī)會(huì),但在許多情況下,直到晚期才診斷出胃癌,這是其5年生存率較低的原因[4]。因此,有必要尋找一種生物標(biāo)志物,用它來對(duì)胃癌進(jìn)行預(yù)防、治療和預(yù)后評(píng)估。

可溶性α2鳥苷環(huán)化酶1(GUCY1A2)是一種異二聚體蛋白,催化三磷酸鳥苷(GTP)轉(zhuǎn)化為3′,5′-環(huán)狀鳥苷一磷酸(GMP)和焦磷酸。先前研究發(fā)現(xiàn)GUCY1A2基因相關(guān)的疾病包括關(guān)節(jié)炎[5]、心肌梗死和肺癌[6]。增殖是腫瘤中最常見的表型,在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用[7-9]。然而目前GUCY1A2基因在胃癌中的作用機(jī)制尚不清楚。因此,本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析GUCY1A2基因在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響,進(jìn)而為闡明GUCY1A2基因在胃癌進(jìn)程中的作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析

本研究通過TCGA官方數(shù)據(jù)庫下載443例胃癌患者的臨床信息和375例胃癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。將下載的443例胃癌臨床信息和375例表達(dá)譜數(shù)據(jù)利用perl軟件和R語言軟件整合將患者按表達(dá)量中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)行分析和繪圖。并利用數(shù)據(jù)進(jìn)行胃癌預(yù)后單因素及多因素分析。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和主要試劑

正常胃黏膜細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞SGC-7901、AGS、MGC-803均購自中科院細(xì)胞研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司,胎牛血清(FBS)、Materigel膠購自浙江天杭生物科技股份有限公司,siRNA、NC所用片段均購自上海吉瑪基因有限公司,Lipofectamin2000由Thermo Scientific公司購買。一抗(GUCY1A2、Ki-67、GAPDH)均購買于Affinity公司,二抗購自武漢三鷹生物科技有限公司,Western blot試劑盒及BCA蛋白濃度測量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司,四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Biofroxx公司。

正常胃黏膜細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞SGC-7901、AGS、MGC-803均采用RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基添加含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素。4種細(xì)胞均培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中。在細(xì)胞增殖至70%融合率時(shí),即用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代,通常3-4 d傳代1次。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,要求轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合達(dá)到60%,嚴(yán)格按照Lip2000及基因片段說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,實(shí)驗(yàn)分組為NC組(Lipofectamine?2000和NC所用片段序列)、siRNA組(Lipofectamine?2000和siRNA序列)。分別用10 μl Lip2000混合4 μg基因片段置入500 μl不含血清培養(yǎng)基靜置20 min后加入培養(yǎng)皿,最終培養(yǎng)液終濃度為1 μg/L,6 h更換不含雙抗僅含10%胎牛血清培養(yǎng)液,48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。siRNA序列為5′-GGTGCGAATGCCACGTTATTG-3′。

1.4 免疫組化檢測GUCY1A2蛋白

選取蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院于2018年1月至2018年12月在外科手術(shù)的胃癌組織蠟塊5例,進(jìn)行切片制備、脫蠟、復(fù)水后對(duì)組織進(jìn)行抗原修復(fù),然后進(jìn)行免疫反應(yīng),滴加一抗(1 ∶200),4 ℃冰箱孵育過夜。加二抗(1 ∶500),室溫孵育1 h。DAB化學(xué)染色,蘇木素復(fù)染。酒精梯度脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。陽性染色結(jié)果判斷:胞漿中的染色面積和棕黃色顆粒決定是否為陽性細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞活力檢測

MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測細(xì)胞活力,取經(jīng)過轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,胰酶消化后用培養(yǎng)基重懸至5×104密度,充分混勻后按100 μl/孔接種于96孔板,每組4個(gè)復(fù)孔,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72 h。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)每孔加入15 μl的MTT,繼續(xù)孵育2 h,用酶標(biāo)儀測定波長為490 nm時(shí)每孔細(xì)胞的吸光度OD值。

1.6 Western blot法檢測GUCY1A2和Ki-67蛋白表達(dá)水平

使用RIPA細(xì)胞裂解液將細(xì)胞在冰上裂解30 min。在4 ℃條件下、14 000 r/min離心10 min,收集上清液。BCA法測量蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)提取物,并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。將膜在含有5%脫脂牛奶中封閉2 h,并分別與GUCY1A2(1 ∶1 000)、Ki-67(1 ∶1 000)、及GAPDH(1 ∶1 000)等一抗4 ℃孵育過夜,隨后與兔二抗(1 ∶1 000)室溫孵育2 h。用ECL顯影液對(duì)條帶進(jìn)行顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次,采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析及兩因素方差分析,組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中的GUCY1A2的表達(dá)量

通過TCGA數(shù)據(jù)分析,結(jié)果顯示非配對(duì)樣本與正常組織相比,GUCY1A2的表達(dá)量表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。而在32對(duì)配對(duì)樣本中與癌旁組織相比,GUCY1A2的表達(dá)量表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

與正常組織相比,*P<0.05圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析GUCY1A在癌旁組織與癌組織中的表達(dá)量Figure 1 Expression of GUCY1A in adjacent and cancerous tissues in TCGA database

2.2 GUCY1A2基因蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

通過對(duì)GUCY1A2在胃癌中的表達(dá)進(jìn)行K-M生存分析,胃癌組織中GUCY1A2高表達(dá)患者生存率顯著高于GUCY1A2低表達(dá)患者生存率(P<0.05,見圖2)。

圖2 胃癌患者GUCY1A2高表達(dá)組與GUCY1A2低表達(dá)組生存率比較Figure 2 Comparison of survival rate between GUCY1A2 high expression group and GUCY1A2 low expression group in gastric cancer patients

2.3 胃癌預(yù)后單因素及多因素分析

采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析后,單因素結(jié)果顯示,GUCY1A2高表達(dá)、年齡大、臨床分期高、TNM分期高是影響胃癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多因素分析顯示,GUCY1A2高表達(dá)、年齡大、男性是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素(見表1)。

表1 GUCY1A2表達(dá)以及臨床特征對(duì)胃癌患者生存率的影響

2.4 GUCY1A2在胃癌組織中高表達(dá)

為探究GUCY1A2在胃癌中的表達(dá)情況,對(duì)胃癌組織及癌旁組織進(jìn)行免疫組化。同時(shí)對(duì)免疫組化鏡下觀察結(jié)果。結(jié)果顯示,胃癌組織中GUCY1A2陽性表達(dá)呈棕色或棕褐色,GUCY1A2蛋白在癌組織中陽性表達(dá)明顯高于癌旁組織(見圖3)。

A.癌旁組織 B.癌組織圖3 GUCY1A2在胃癌組織中高表達(dá) (×200)Figure 3 GUCY1A2 is highly expressed in gastric cancer tissues (×200)

2.5 GUCY1A2在胃癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常胃黏膜細(xì)胞相比,胃癌細(xì)胞中SGC-7901、AGS、MGC-803的GUCY1A2表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。由于SGC-7901細(xì)胞和AGS細(xì)胞中GUCY1A2表達(dá)升高最顯著,因此選擇SGC-7901細(xì)胞株和AGS細(xì)胞株作為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)研究。

與GES-1細(xì)胞相比,*P<0.05圖4 GUCY1A2在正常人胃黏膜細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)Figure 4 Expression of GUCY1A2 in normal human gastric mucosa cells and gastric cancer cells

2.6 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后GUCY1A2表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示,胃癌細(xì)胞株SGC-7901和胃癌細(xì)胞株AGS轉(zhuǎn)染后,siRNA組的GUCY1A2蛋白表達(dá)量,與NC對(duì)照組相比顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。因此轉(zhuǎn)染沉默GUCY1A表達(dá)水平是有效的。

與NC組比較,*P<0.05圖5 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后胃癌株SGC-7901和AGS細(xì)胞中GUCY1A2的表達(dá)水平Figure 5 Expression of GUCY1A2 in SGC-7901 cells and AGS cells at 48 h after transfection with siRNA

2.7 MTT檢測轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞增殖作用

MTT結(jié)果顯示,胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS沉默GUCY1A2的表達(dá)水平后顯著抑制了胃癌細(xì)胞的生長速度及細(xì)胞活性,于培養(yǎng)48 h和72 h時(shí)各沉默組與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。說明GUCY1A2表達(dá)下降可以顯著抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS的體外增殖能力。

與NC組比較,*P<0.05圖6 胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS沉默GUCY1A2后的細(xì)胞增殖Figure 6 Cell proliferation of gastric cancer cells SGC-7901 and AGS after silencing GUCY1A2

2.8 GUCY1A2對(duì)胃癌細(xì)胞內(nèi)增殖指標(biāo)Ki-67的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,沉默GUCY1A2表達(dá)量后,與NC對(duì)照組比較,siRNA組Ki-67蛋白水平顯著下降(P<0.05,見圖7)。說明GUCY1A2表達(dá)下降可以顯著抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS的體外增殖能力。

與NC組比較,*P<0.05圖7 沉默GUCY1A2對(duì)增殖標(biāo)志物Ki-67的影響Figure 7 The effect of silencing GUCY1A2 on proliferation marker Ki-67 in SGC-7901 and AGS cells

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤,是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥死亡原因之一。胃癌患者通常只在晚期出現(xiàn)癥狀。然而,大多數(shù)患者直到出現(xiàn)癥狀才得到醫(yī)療關(guān)注。在最終診斷時(shí),許多胃癌患者由于處于疾病的晚期,治療效果較差。目前,胃癌的診斷依賴于胃鏡檢查和病理評(píng)估,需要對(duì)患者進(jìn)行侵襲性的程序。然而,在一些患者中,即使這種方法也可能無法明確診斷。因此,研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)生物學(xué)標(biāo)志物具有重要的意義。近年來,在子宮內(nèi)膜癌[10]和肺腺癌[11]中不斷發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物。胃癌的發(fā)展是一個(gè)多因素的過程,它經(jīng)歷了許多不同的階段,每個(gè)階段都受到蛋白編碼基因和非編碼基因的遺傳和表觀遺傳的調(diào)節(jié)[12],如DNA水平[13]、mRNA水平[14]、微小RNA小分子(miRNAs)[15]及蛋白的表達(dá)改變[16]均可影響胃癌的進(jìn)展。近年來隨著高通量測序及基因芯片技術(shù)的發(fā)展,越來越多的癌癥潛在基因治療靶點(diǎn)被研究發(fā)現(xiàn)[17,18],這也為診斷和治療胃癌提供了一個(gè)新的方向。

GUCY1A2基因編碼的蛋白質(zhì)是復(fù)合物的一個(gè)亞基,它與亞基相互作用形成被一氧化氮激活的鳥苷酸環(huán)化酶。該基因已發(fā)現(xiàn)編碼不同亞型的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄變種。然而,目前關(guān)于GUCY1A2基因的功能作用尚無相關(guān)報(bào)道,尤其GUCY1A2基因在胃癌中的功能機(jī)制未見任何研究。本研究分析TCGA數(shù)據(jù)庫臨床信息和基因表達(dá)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)正常胃組織中GUCY1A2的表達(dá)情況明顯低于癌組織中的表達(dá),并且通過K-M分析顯示胃癌組織中GUCY1A2高表達(dá)患者生存率顯著低于GUCY1A2低表達(dá)患者生存率。同時(shí),通過多因素分析,GUCY1A2高表達(dá)、年齡大、男性與胃癌患者預(yù)后有明顯的相關(guān)性。因此,我們得出GUCY1A2基因可能與胃癌的預(yù)后相關(guān)。隨后我們通過免疫組化檢測癌組織的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)GUCY1A2在癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織。Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GUCY1A2基因與正常胃黏膜細(xì)胞相比,在胃癌細(xì)胞系中表達(dá)量上升。以胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,沉默GUCY1A2表達(dá)水平通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其顯著抑制細(xì)胞增殖能力。同時(shí)利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測增殖標(biāo)志物Ki-67表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)沉默GUCY1A2后,Ki-67蛋白水平顯著下降。因此我們認(rèn)為GUCY1A2的表達(dá)降低能夠明顯抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述,本研究證明GUCY1A2基因在胃癌中是促癌基因,研究討論并證實(shí)了沉默GUCY1A2能夠抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901和AGS細(xì)胞的增殖能力,這提示GUCY1A2能對(duì)胃癌細(xì)胞增殖起到重要作用,或許可以作為胃癌臨床治療的一個(gè)重要靶標(biāo)。