張 娜,石雪峰

(青海省人民醫(yī)院呼吸科,青海 810000)

肺間質(zhì)纖維化是一種呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)的慢性進(jìn)展性肺部疾病,細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積、肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞廣泛增殖、肺泡上皮細(xì)胞損傷和肺組織結(jié)構(gòu)異常重塑等是其重要的病理特征[1-3]。臨床上,多以抗炎和激素類藥物來(lái)緩解病情,目前尚無(wú)根治的方法[4]。大量研究顯示,在肺間質(zhì)纖維化過(guò)程中存在異常表達(dá)的微小RNA(microRNA,miRNA),而這些miRNAs可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因影響肺成纖維細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,起到促進(jìn)或抑制纖維化的作用[5,6]。近年來(lái),有研究證實(shí),miR-486具有抑制肺間質(zhì)纖維化的作用[4],但其作用機(jī)制并不完全清楚。胞質(zhì)分裂作用因子3(dedicator of cytokinesis 3,DOCK3)是鳥嘌呤核苷酸交換因子家族成員,可通過(guò)激活小G蛋白影響下游相關(guān)信號(hào)通路,在細(xì)胞骨架重組方面發(fā)揮著重要作用,與肺纖維化、癲癇和腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-9]。本研究開展前期采用TargetScanHuman生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到miR-486與DOCK3 3′非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn),故猜測(cè)miR-486可能通過(guò)靶向調(diào)控DOCK3表達(dá)參與肺間質(zhì)纖維化發(fā)病過(guò)程;為此,本研究以體外培養(yǎng)的正常人肺成纖維細(xì)胞為基礎(chǔ),探討miR-486是否通過(guò)靶向調(diào)控DOCK3在肺間質(zhì)纖維化中發(fā)揮抗纖維化作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人肺成纖維細(xì)胞系NHLF(北京澤平科技有限責(zé)任公司),高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol、脂質(zhì)體2000、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),pGL3-basic熒光素酶報(bào)告載體(上海海吉浩格生物科技有限公司),miR-486模擬物(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司),DOCK3過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒(上海漢恒生物科技有限公司),兔抗人DOCK3多克隆抗體和重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)(北京百奧萊博科技有限公司)、兔抗人I型膠原蛋白(collagen Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅲ)、E鈣黏附蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)多克隆抗體和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)。

1.2 細(xì)胞分組與處理

采用含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)在5% CO2、飽和濕度的37 ℃常規(guī)培養(yǎng)NHLF細(xì)胞。以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組,以含10 ng/ml TGF-β1的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為誘導(dǎo)組[10],將miR-486模擬物及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后以含10 ng/ml TGF-β1完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為誘導(dǎo)+miR-486組和誘導(dǎo)+miR-NC組,將miR-486模擬物與空載體質(zhì)粒及DOCK3過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后以含10 ng/ml TGF-β1完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為誘導(dǎo)+miR-486+vector組和誘導(dǎo)+miR-486+DOCK3組,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺成纖維細(xì)胞接種至6孔板,常規(guī)培養(yǎng)至70%-80%融合度時(shí),按照實(shí)驗(yàn)分組參照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書步驟將miR-486模擬物、DOCK3過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒以及相應(yīng)的對(duì)照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染5 h,換新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

采用TargetScanHuman生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到miR-486和DOCK3 3′UTR之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。將含miR-486和DOCK3 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)的片段序列克隆重組至熒光素酶報(bào)告基因載體,以構(gòu)建DOCK3野生型載體質(zhì)粒(DOCK3-WT);而將miR-486和DOCK3 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)突變后的片段序列克隆重組至熒光素酶報(bào)告基因載體上來(lái)構(gòu)建DOCK3突變型載體質(zhì)粒(DOCK3-MUT)。參照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書將構(gòu)建的載體質(zhì)粒分別與miR-486模擬物及其陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48 h后按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-486表達(dá)水平

收集處理結(jié)束后的對(duì)照組、誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)+miR-NC組和誘導(dǎo)+miR-486組細(xì)胞,加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA后,將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板,根據(jù)銳博生物合成的引物上熒光定量PCR儀擴(kuò)增。以U6為管家基因,采用2-ΔΔCt法檢測(cè)細(xì)胞中miR-486表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。其中,miR-486上游引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;U6上游引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列:5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)DOCK3、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平

收集處理結(jié)束后的各組細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液抽提細(xì)胞總蛋白后,采用考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白濃度。將變性后的蛋白樣品行電泳分離后,轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉封閉后,以DOCK3(1 ∶500)、collagen Ⅰ(1 ∶1 000)、collagen Ⅲ(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶500)、α-SMA(1 ∶1 000)、vimentin(1 ∶800)和β-actin(1 ∶1 000)抗體4 ℃孵育過(guò)夜;經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h,電化學(xué)發(fā)光法顯影曝光;以β-actin為內(nèi)參,采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組比較行t檢驗(yàn);多組間比較行單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-486和DOCK3靶向關(guān)系的驗(yàn)證結(jié)果

TargetScanHuman生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,miR-486和DOCK3 3′UTR之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖1)。與miR-NC+DOCK3-WT比較,miR-486+DOCK3-WT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低(0.34±0.03vs0.98±0.05,t=32.928,P<0.05);但miR-NC+DOCK3-MUT和miR-486+DOCK3-MUT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.95±0.06vs1.01±0.08,t=1.800,P=0.090 7>0.05)。

圖1 TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-486和DOCK3 3′UTR之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)Figure 1 Complementary binding sites between miR-486 and DOCK3 3′UTR predicted by Targetscan software

2.2 轉(zhuǎn)染miR-486模擬物對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞中miR-486和DOCK3表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較,誘導(dǎo)組細(xì)胞中miR-486表達(dá)水平明顯降低,而DOCK3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);然而,miR-NC組和誘導(dǎo)組之間miR-486和DOCK3蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與誘導(dǎo)+miR-NC組比較,誘導(dǎo)+miR-486組細(xì)胞中miR-486表達(dá)水平明顯升高,而DOCK3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05,見(jiàn)圖2和表1)。

圖2 免疫印跡法檢測(cè)DOCK3蛋白表達(dá)Figure 2 The expression of DOCK3 protein by Western blot

表1 各組細(xì)胞中miR-486和DOCK3蛋白表達(dá)水平比較

2.3 miR-486過(guò)表達(dá)對(duì)肺成纖維細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組、誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)+miR-NC組和誘導(dǎo)+miR-486組細(xì)胞中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=349.177,223.119,均P<0.05)。與對(duì)照組比較,誘導(dǎo)組細(xì)胞中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與誘導(dǎo)組比較,誘導(dǎo)+miR-NC組細(xì)胞中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與誘導(dǎo)+miR-NC組比較,誘導(dǎo)+miR-486組細(xì)胞中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與誘導(dǎo)+miR-NC組比較,#P<0.05圖3 miR-486過(guò)表達(dá)對(duì)肺成纖維細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of miR-486 overexpression on collagen expression in lung fibroblasts

2.4 miR-486過(guò)表達(dá)對(duì)肺成纖維細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

對(duì)照組、誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)+miR-NC組和誘導(dǎo)+miR-486組細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=175.258,84.245,223.175,P均<0.05)。與對(duì)照組比較,誘導(dǎo)組細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低,而間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與誘導(dǎo)組比較,誘導(dǎo)+miR-NC組細(xì)胞E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);但誘導(dǎo)+miR-486組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平較誘導(dǎo)+miR-NC組明顯升高,而α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平較誘導(dǎo)+miR-NC組明顯降低(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與誘導(dǎo)+miR-NC組比較,#P<0.05圖4 miR-486過(guò)表達(dá)對(duì)肺成纖維細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Figure 4 Effect of miR-486 overexpression on epithelial mesenchymal transition of lung fibroblasts

2.5 上調(diào)DOCK3表達(dá)對(duì)miR-486過(guò)表達(dá)的肺成纖維細(xì)胞膠原蛋白和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

誘導(dǎo)+miR-486組、誘導(dǎo)+miR-486+vector組和誘導(dǎo)+miR-486+DOCK3組細(xì)胞中DOCK3、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=465.500,35.206,140.824,106.676,248.029,47.634,均P<0.05)。與誘導(dǎo)+miR-486組比較,誘導(dǎo)+miR-486+vector組細(xì)胞中DOCK3、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與誘導(dǎo)+miR-486+vector組比較,誘導(dǎo)+miR-486+DOCK3組細(xì)胞中DOCK3、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平均明顯升高,而E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05,見(jiàn)圖5)。

與誘導(dǎo)+miR-486+vector組比較,*P<0.05圖5 上調(diào)DOCK3表達(dá)對(duì)miR-486過(guò)表達(dá)的肺成纖維細(xì)胞膠原蛋白和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Figure 5 Effects of up-regulating DOCK3 expression on collagen and epithelial mesenchymal transition of miR-486-overexpressed lung fibroblasts

3 討論

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞喪失原有極性轉(zhuǎn)化為有侵襲和遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞的生理過(guò)程,而肺泡上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可促進(jìn)成纖維母細(xì)胞灶的形成,引起膠原蛋白和纖維蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過(guò)分沉積,加重肺泡結(jié)構(gòu)損傷,最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化[5,11]。TGF-β1是肺間質(zhì)纖維化發(fā)病過(guò)程中重要的炎性因子,可通過(guò)調(diào)控SMADS蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)膠原collagen Ⅰ和collagen Ⅲ等細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積,被認(rèn)為是重要的致纖維化因子[12-14]。本研究以10 ng/ml TGF-β1刺激人肺成纖維細(xì)胞后,膠原蛋白collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、vimentin蛋白表達(dá)明顯升高,而上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低。結(jié)果表明,TGF-β1可通過(guò)介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致膠原合成增加,細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積,肺纖維化細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

miRNAs是一類內(nèi)源性非編碼RNA,可通過(guò)與靶基因3′UTR堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合調(diào)控其表達(dá),在細(xì)胞增殖、分化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,與包括肺纖維化在內(nèi)的多種組織器官纖維化疾病的發(fā)生密切相關(guān)[15-18]。本研究結(jié)果顯示,TGF-β1可使肺成纖維細(xì)胞中miR-486表達(dá)水平明顯降低,而miR-486過(guò)表達(dá)可通過(guò)下調(diào)α-SMA蛋白表達(dá);該結(jié)果與Ji等[19]研究所得到的miR-486可通過(guò)抑制SMAD2表達(dá)下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)組分纖黏蛋白和α-SMA蛋白表達(dá)抑制成纖維細(xì)胞增殖與分泌而發(fā)揮抗纖維化作用的結(jié)果相吻合。此外,本研究結(jié)果顯示,miR-486過(guò)表達(dá)可明顯抑制TGF-β1對(duì)成纖維細(xì)胞中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果表明,miR-486過(guò)表達(dá)可通過(guò)減弱膠原合成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺纖維化。

DOCK3是鳥嘌呤核苷酸交換因子家族成員,不僅可通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展[20],還在肺纖維化患者中異常高表達(dá),與肺間質(zhì)纖維化發(fā)病密切相關(guān)[9]。本研究采用TargetScanHuman生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,miR-486與DOCK3 3′UTR端存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn);雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-486可與DOCK3靶向結(jié)合;此外,TGF-β1刺激可使成纖維細(xì)胞中DOCK3蛋白表達(dá)水平明顯升高,而miR-486過(guò)表達(dá)可抑制TGF-β1對(duì)DOCK3蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。結(jié)果表明,DOCK3是miR-486的潛在靶基因,miR-486可負(fù)向調(diào)控DOCK3蛋白表達(dá)。該結(jié)果提示,miR-486靶向調(diào)控DOCK3可能是其抗纖維化的重要機(jī)制。通過(guò)轉(zhuǎn)染DOCK3過(guò)表達(dá)載體成功上調(diào)DOCK3表達(dá)后,DOCK3可通過(guò)促進(jìn)collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、α-SMA、vimentin和抑制E-cadherin蛋白表達(dá)促進(jìn)miR-486過(guò)表達(dá)的肺成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明,DOCK3過(guò)表達(dá)可促進(jìn)成纖維化細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。提示,在肺間質(zhì)纖維化過(guò)程中,DOCK3可通過(guò)介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)纖維化,而miR-486可通過(guò)靶向下調(diào)其表達(dá)發(fā)揮抗纖維化作用。

綜上所述,DOCK3是miR-486的潛在靶基因,miR-486可通過(guò)靶向調(diào)控其表達(dá)抑制肺成纖維細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而起到抗肺間質(zhì)纖維化的作用。該結(jié)果在細(xì)胞水平上初步揭示了miR-486抗纖維化機(jī)制與其靶向調(diào)控DOCK3表達(dá)有關(guān),但缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù),后期將通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,以期為miR-486用于肺纖維化的靶向治療提供參考依據(jù)。