馮 倩,趙海鷗,馬紅梅,楊文婷*

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,西安 710061;2天津市河北區(qū)王串場(chǎng)街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心;*通訊作者,E-mail:04203031@stu.xjtu.edu.cn)

宮頸癌是全球第六大高發(fā)和致死性癌癥[1]。然而,在發(fā)展中國(guó)家,宮頸癌仍是女性第二大高發(fā)和第三大致死性癌癥,而且發(fā)病趨于年輕化。其致死性原因主要為發(fā)現(xiàn)時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)的中/晚期和復(fù)發(fā)性宮頸癌。腫瘤干細(xì)胞是一群具有自我更新、多向分化、無限增殖及極強(qiáng)致瘤性等生物學(xué)特性的亞群細(xì)胞,同時(shí)又由于其所特有的細(xì)胞生物學(xué)特性,癌基因表達(dá)譜和腫瘤微環(huán)境等使其具有極強(qiáng)的抗放化療和轉(zhuǎn)移侵襲能力,成為臨床放/化療失敗、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及最終導(dǎo)致患者死亡的主要原因[2]。

CD49f,即整合素α6(integrin α6),是具有黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的黏附分子整合素家族成員之一,能夠與多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合,參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和黏附等過程[3]。CD49f是包括胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞等干細(xì)胞的表面標(biāo)志[4-6]。近年來,CD49f被證實(shí)可作為多種癌癥干細(xì)胞的表面標(biāo)志[7],調(diào)控癌干細(xì)胞的增殖、分化和遷移[8-10],其在干細(xì)胞培養(yǎng)基富集的宮頸癌細(xì)胞腫瘤球中表達(dá)增加,提示其可能參與宮頸癌的進(jìn)展,與宮頸癌干細(xì)胞特性的維持相關(guān)[11],但并未見研究報(bào)道證實(shí)。本研究通過流式細(xì)胞技術(shù)分選獲得CD49fhigh和CD49flow的宮頸癌亞群細(xì)胞,研究CD49f在維持體外癌干細(xì)胞特性(自我更新能力、分化能力和抗化療藥物等)中的作用,為進(jìn)一步證實(shí)CD49f能夠作為宮頸癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM/High Glucose,Mc Coy’s 5A,RPMI-1640,DMEM/F12和胎牛血清(FBS)購自美國(guó)HyClone公司;氨卞青霉素鈉、硫酸鏈霉素和MTT均購自美國(guó)Sigma公司;CD49f單克隆抗體和CD49f-FITC流式抗體分別購自美國(guó)Abcam公司和BD公司;羊抗鼠免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司;順鉑和5-氟尿嘧啶購自山東齊魯藥業(yè);干細(xì)胞培養(yǎng)基相關(guān)因子N2,B27購自美國(guó)GIBCO公司,EFG和FGF購自美國(guó)Peprotech公司;流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(BD FACS Aria)購自美國(guó)BD公司。

1.2 宮頸癌細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌細(xì)胞系HeLa,SiHa,C33A,HT-3和CaSki購自ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA),并由本課題組西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部環(huán)境與基因相關(guān)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清,1 000 μg/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM/High Glucose細(xì)胞培養(yǎng)液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞,待單層細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合時(shí),用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞,收集細(xì)胞備用。

1.3 生物信息數(shù)據(jù)庫

CD49f轉(zhuǎn)錄本水平在宮頸癌組織和正常宮頸組織中表達(dá)的差異采用腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。GEPIA數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析獲得正常宮頸組織13例,宮頸癌組織305例。GEO數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus)篩選獲得正常宮頸組織36例,宮頸癌組織58例。分別分析CD49f轉(zhuǎn)錄本水平的表達(dá)差異,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CD49f蛋白在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

宮頸癌細(xì)胞系HeLa,SiHa,C33A,HT-3和CaSki培養(yǎng)于鋪有80 mm×80 mm爬片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度后棄培養(yǎng)基,PBS沖洗2次,40 g/L多聚甲醛固定30 min,1 ml/L的Triton X-100室溫孵育20 min?？乖迯?fù)采用pH6.0的檸檬酸鈉高壓修復(fù)2 min;30 ml/L的H2O2室溫封閉10 min。50 ml/L山羊血清封閉20 min,鼠抗人CD49f單克隆抗體(1 ∶200)4 ℃孵育過夜。次日,PBS沖洗2次,生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG室溫孵育20 min;鏈霉親和素標(biāo)記的DAB顯色劑顯色,蘇木精復(fù)染,中性樹膠封片,顯微鏡觀察。對(duì)照組采用正常小鼠血清替代抗體。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD49f蛋白在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

將備檢測(cè)的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化,PBS清洗2次,調(diào)整細(xì)胞濃度至105/ml,CD49f抗體100 μl冰上孵育1 h,預(yù)冷的PBS清洗2次,并用濾膜進(jìn)行過濾,上機(jī)檢測(cè)或者分選CD49f的表達(dá)及所需要的細(xì)胞,以小鼠來源的IgG作對(duì)照。對(duì)于細(xì)胞分選,以CD49f陽性上限的5%和陰性下限的5%進(jìn)行畫門分群,進(jìn)行分選,并分別定義為CD49fhigh和CD49flow兩群細(xì)胞。分選好的細(xì)胞直接進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞活力檢測(cè)

細(xì)胞以1×103濃度接種于96孔板中,連續(xù)7 d檢測(cè)細(xì)胞活力。細(xì)胞經(jīng)0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液染色4-6 h,加入DMSO溶解,在分光光度計(jì)波長(zhǎng)570 nm測(cè)定吸光度并繪制曲線圖。對(duì)于藥敏實(shí)驗(yàn),1×103細(xì)胞接種于96孔板過夜貼壁后,將含有不同濃度的化療藥物作用細(xì)胞72 h后,檢測(cè)細(xì)胞活力。順鉑藥物濃度為0,3,6,12 μg/ml,5-氟尿嘧啶濃度分別為0,30,60,120 μg/ml。

1.7 腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)

采用含有干細(xì)胞因子FGF、EGF、N2和B27的DMEM/F12干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)。以每孔1個(gè)細(xì)胞的數(shù)量分選細(xì)胞至9孔板中,用干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),每3 d增加20 μl新的培養(yǎng)基,觀察至12-15 d,統(tǒng)計(jì)每組細(xì)胞腫瘤球形成的數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗(yàn)和One-way ANOVA檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD49f在宮頸癌中的表達(dá)

TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫分析顯示,CD49f轉(zhuǎn)錄本水平在宮頸癌組織中均一致性地高于正常宮頸組織(見圖1,P<0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CD49f蛋白在宮頸癌細(xì)胞系HeLa,SiHa,C33A,HT-3和CaSki中均有表達(dá)且定位于細(xì)胞膜(見圖2)。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀結(jié)果顯示CD49f在HeLa,SiHa,C-33A,HT-3和CaSki細(xì)胞中表達(dá)的陽性率分別為90.8%,26.3%,21.7%,19.8%和32.9%(見圖3)。

與正常宮頸組織相比，*P<0.05圖1 GEPIA和TCGA數(shù)據(jù)庫分析CD49f轉(zhuǎn)錄本水平在宮頸癌和正常宮頸中的表達(dá)Figure 1 CD49f mRNA level in cervical cancer and normal cervix by GEPIA and TCGA databases

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD49f蛋白在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá) (×1 000)Figure 2 The expression of CD49f protein in cervical cancer cell lines by IHC (×1 000)

圖3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD49f蛋白在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)Figure 3 The expression of CD49f protein in cervical cancer cell lines by flow cytometry

2.2 CD49fhigh宮頸癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抵抗化療藥的特性

為明確CD49f在宮頸癌惡性生物學(xué)行為中的作用,流式細(xì)胞技術(shù)儀分選獲得CD49fhigh和CD49flow的兩群細(xì)胞。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CD49f在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)的高低對(duì)細(xì)胞增殖能力影響的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖4)。CD49f對(duì)化療藥物的敏感性的研究顯示,HeLa-CD49fhigh細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶和順鉑的敏感性均顯著低于HeLa-CD49flow細(xì)胞群,且呈濃度依賴性趨勢(shì)。在C33A-CD49fhigh和C33A-CD49flow細(xì)胞群中得到同樣的結(jié)果(見圖5,P<0.05)。

圖4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)親本細(xì)胞CD49fhigh和CD49flow細(xì)胞亞群的增殖活力Figure 4 Cell viability of parent, CD49fhigh and CD49flow populations detected by MTT assay

與CD49flow比較,*P<0.05圖5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)親本細(xì)胞CD49fhigh和CD49flow細(xì)胞亞群對(duì)化療藥的敏感性Figure 5 Sensitivity of parent, CD49fhigh and CD49flow populations to chemotherapeutic drugs by MTT assay

2.3 CD49fhigh宮頸癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的體外腫瘤球形成能力

有限稀釋法結(jié)合體外腫瘤球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SiHa-CD49fhigh細(xì)胞的成球率為10.31%±4.23%,較SiHa-CD49flow細(xì)胞的成球率(3.72%±1.03%)顯著增加(P<0.05)。同時(shí),在HeLa和C33A細(xì)胞中CD49fhigh細(xì)胞群的腫瘤球形成能力亦顯著高于CD49flow細(xì)胞群,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。通過連續(xù)傳代腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩群細(xì)胞的體外自我更新能力,結(jié)果顯示,CD49fhigh細(xì)胞群在SiHa,HeLa和C33A細(xì)胞中第三代腫瘤球形成率分別為(13.28±3.28)%,(26.32±9.21)%和(26.42±8.24)%,均顯著高于CD49flow群細(xì)胞的體外成球率[(5.03±2.31)%,(18.34±7.82)%和(18.76±4.23)%],差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖6和表1)。

表1 CD49fhigh和CD49flow兩組細(xì)胞腫瘤球形成率和自我更新能力的比較

圖6 腫瘤球形成能力和自我更新能力檢測(cè)Figure 6 Tumorsphere formation ability and self-renewal ability

2.4 CD49fhigh宮頸癌細(xì)胞具有體外分化能力

分選后的細(xì)胞進(jìn)行體外分化培養(yǎng),檢測(cè)CD49f蛋白表達(dá)的變化,結(jié)果顯示,CD49f高表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞SiHa、HeLa和C33A經(jīng)過分化培養(yǎng)3代后,CD49f蛋白的表達(dá)明顯降低;連續(xù)傳6代后,CD49f蛋白的表達(dá)恢復(fù)到親本細(xì)胞中CD49f的表達(dá)水平(見圖7)。以上結(jié)果提示CD49f陽性的宮頸癌細(xì)胞具有體外分化能力。

圖7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分化培養(yǎng)后CD49fhigh細(xì)胞群中CD49f蛋白的表達(dá)變化Figure 7 The expression of CD49f protein in CD49fhigh cells cultured with differentiation medium by flow cytometry

3 討論

CD49f參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,與癌癥干細(xì)胞特性相關(guān)。CD49f在前列腺良性和惡性細(xì)胞形成的球體中高表達(dá),并且與多種腫瘤細(xì)胞的始動(dòng)相關(guān),包括結(jié)腸癌和乳腺癌等[12,13]。此外,在小鼠腫瘤中,CD49f陽性的細(xì)胞具有更高的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[14]。因此推測(cè)CD49f可能是治療癌癥的有價(jià)值的靶點(diǎn)之一。

目前,對(duì)宮頸癌干細(xì)胞的研究表明,LGR5[15],SOX2[16]和DAX1[17]等均參與了宮頸癌干細(xì)胞特性的維持。值得一提的是,HPV18和HPV16作為宮頸癌發(fā)生的必要條件性因子,能夠靶向OCT4,HES1,EGF和TGF-β激活下游干細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路,增加致瘤能力和抑制分化能力[18]。但關(guān)于宮頸癌干細(xì)胞確切的調(diào)控機(jī)制和特異性抗原仍不完全清楚。本研究中,數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示CD49f轉(zhuǎn)錄本水平在宮頸癌組織中顯著增加,提示CD49f在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮促進(jìn)作用。采用表面標(biāo)記CD49f分選獲得CD49f高表達(dá)和低表達(dá)的兩群細(xì)胞,分析CD49f的表達(dá)對(duì)宮頸癌惡性生物學(xué)行為的影響和在維持癌干細(xì)胞特征中的作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CD49f表達(dá)的高低與宮頸癌細(xì)胞的增殖活力無關(guān),提示CD49f不是通過影響宮頸癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力發(fā)揮促癌作用的。因此,我們進(jìn)一步探索CD49f是否對(duì)癌干細(xì)胞特征的維持發(fā)揮作用?以往研究已證實(shí)癌干細(xì)胞具有高致瘤性和自我更新能力,抗分化能力和抗常規(guī)放化療治療等特征。本研究中,CD49fhigh細(xì)胞具有比CD49flow細(xì)胞更強(qiáng)的自我更新能力和抗分化和化療藥物能力,提示CD49f可能通過調(diào)控宮頸癌干細(xì)胞特性的維持發(fā)揮促癌作用。關(guān)于CD49f在宮頸癌干細(xì)胞中的作用,已有研究表明,HeLa細(xì)胞經(jīng)富集培養(yǎng)的腫瘤球中CD49f的表達(dá)顯著增加[19],與本研究中的結(jié)果是一致的。另外,腫瘤干細(xì)胞作為導(dǎo)致腫瘤始動(dòng)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的元兇通常被認(rèn)為與細(xì)胞增殖能力包括細(xì)胞生長(zhǎng)和周期進(jìn)展無關(guān),也有報(bào)道腫瘤干細(xì)胞反而具有較非腫瘤細(xì)胞較弱的增殖能力[20]。這一點(diǎn)可以很好地解釋CD49f表達(dá)的高低與宮頸癌細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞活力無顯著相關(guān),更加提示CD49f作為宮頸癌干細(xì)胞標(biāo)記的可能性,有望成為宮頸癌干細(xì)胞的新標(biāo)記和靶向治療的潛在新靶點(diǎn)。然而,其在維持宮頸癌干細(xì)胞體內(nèi)特征和下游調(diào)控機(jī)制的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上,癌干細(xì)胞作為腫瘤始動(dòng)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源,其在腫瘤組織中的轉(zhuǎn)歸就直接關(guān)系患者的預(yù)后結(jié)局,因此闡明癌干細(xì)胞的分子標(biāo)記和調(diào)控機(jī)制對(duì)于靶向癌干細(xì)胞的治療具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。對(duì)于宮頸癌,尤其是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及HPV陰性的宮頸癌患者,研究其干性調(diào)控基因和分子機(jī)制,能夠提供有效的預(yù)后提示和潛在的治療靶點(diǎn)。