李樹民徐洪楊奕李雅倩靳馥宇李田楊秀紅楊方?

(1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,河北 唐山 063210;2.華北理工大學(xué)河北省器官纖維化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 唐山 063210;3.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 唐山 063210;4.華北理工大學(xué)教務(wù)處,河北 唐山 063210)

肢體缺血再灌注(limb ischemia-reperfusion,LIR)是臨床上常見的病理征象,與血栓形成,栓塞,創(chuàng)傷和長(zhǎng)期使用止血帶有關(guān)[1]。肢體恢復(fù)供血后,自由基產(chǎn)生增加,導(dǎo)致細(xì)胞鈣超載,引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞相互作用,炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子激活、釋放,不僅會(huì)造成肢體缺血壞死,還會(huì)造成其他非缺血器官的損傷,嚴(yán)重者引起多臟器功能衰竭,甚至危及生命[2]。肺由于血液循環(huán)豐富,而且是靜脈血液返回心臟后首個(gè)供血器官,最容易受到LIR影響[3],導(dǎo)致急性肺損傷(acute lung injury,ALI)甚至急性呼吸窘迫綜合征[4]。但是,LIR引起ALI的機(jī)制尚未得到充分闡明。

最近研究證實(shí),肺組織局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system,RAS)穩(wěn)態(tài)失衡與ALI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。RAS兩條作用軸的正負(fù)調(diào)控平衡在維持正常生理功能中發(fā)揮重要作用。其中,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme,ACE),及其效應(yīng)分子血管緊張素II(angiotensin,Ang II)和血管緊張素II受體1(AT1)軸的激活是ALI發(fā)生發(fā)展的重要因素[7-9];隨后發(fā)現(xiàn)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2),將Ang II水解生成血管緊張素-(1-7)[Ang-(1-7)],Ang-(1-7)通過與G蛋白偶聯(lián)受體Mas結(jié)合,發(fā)揮抗炎,抗纖維化,抗增殖和血管舒張作用[10-12]。因此,ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸可能是肺損傷治療的潛在靶標(biāo)。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在LIR誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中,小鼠肺組織ACE,Ang II/Ang-(1-7)和AT1/Mas表達(dá)增加,ACE2表達(dá)減少。給予ACE2激活劑三氮脒(diminazene aceturate,DIZE)預(yù)處理4周能夠逆轉(zhuǎn)這些變化,肺損傷程度減輕。此外,與野生型小鼠相比,給予ACE2過表達(dá)小鼠DIZE處理后,DIZE也可逆轉(zhuǎn)急性肺損傷引起的RAS穩(wěn)態(tài)失衡,而且效果更加明顯[13]。這些結(jié)果提示,ACE2在急性肺損傷中發(fā)揮了重要的保護(hù)作用。然而,ACE2激活后,其作用是否通過ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸發(fā)揮目前尚不清楚。因此,本研究采用ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠(過表達(dá)ACE2基因),構(gòu)建LIR誘導(dǎo)的急性肺損傷模型,給予特異性ACE2抑制劑MLN-4760和特異性Mas受體阻斷劑A779干預(yù),探討ACE2在急性肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制,旨在發(fā)現(xiàn)治療ALI的新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8～12周齡ACE2轉(zhuǎn)基因雄性ICR小鼠72只,體重(28±5)g,在華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房繁殖、飼養(yǎng)【SYXK(冀)2015-0038】。SPF級(jí)8～12周齡野生型ICR小鼠36只,體重(30±5)g,由北京維通利華公司提供【SCXK(京)2016-0001】。所有小鼠自由進(jìn)食水,飼養(yǎng)環(huán)境溫度23～25℃,濕度35%～55%,12 h光照/黑暗周期。所有實(shí)驗(yàn)程序均已獲得華北理工大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2013-038和2017-025)。

1.1.2 主要試劑與儀器

A779(4030357:Bachem,瑞士);MLN-4760(530616;Millipore,德國);兔單克隆 ACE(EPR2757)、ACE2 [EPR4435(2)]、AT1(EPR3873)抗體(Epitomics,美國);鼠單克隆Mas抗體(sc-390453;Santa Cruz Biotechnology,美國);兔單克隆β-actin抗體(AC026;ABclonal Science Inc,美國);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(5220-0336)、山羊抗鼠(5220-0341)二抗(SeraCare,美國);BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(PQ0012;聯(lián)科生物,中國);Ang II(CSB-E04495 m)/Ang-(1-7)(CSB-E13763 m)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(Cusabio,美國);白介素-6(interleukin-6,IL-6,RK00008)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α,RK00027)ELISA試劑盒(ABclonal Science Inc,美國);TRIzol(15596-018,Invitrogen,美國);反轉(zhuǎn)錄(ZR102-2)和qRT-PCR(ZF102-2)試劑盒(北京莊盟,中國);引物序列Thermo Fisher Scientific。

熒光顯微鏡(BX53,日本OLYMPUS);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9140 A,上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司);酶標(biāo)儀(iMarkTM;Bio-rad,美國);Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific,美國)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

野生型ICR小鼠隨機(jī)分為2組,每組18只:(1)野生對(duì)照組(Control),(2)野生模型組(Model)。ACE2基因過表達(dá)ICR小鼠隨機(jī)分為4組,每組18只:(1)ACE2對(duì)照組(ACE2+Control);(2)ACE2模型組(ACE2+Model),(3)ACE2模型+A779干預(yù)組(ACE2+Model+A779)和(4)ACE2模型+MLN-4760干預(yù)組(ACE2+Model+MLN-4760)。除2個(gè)對(duì)照組外,其余各組均制備LIR模型。藥物干預(yù)組分別在模型建立前給予A779(5 mg/(kg·d),s.c.)和MLN-4760(1 mg/(kg·d),s.c.)4周預(yù)處理。對(duì)照組和模型組皮下注射等量生理鹽水4周。

1.2.2 模型制備與樣本處理

采用我室常規(guī)方法制備LIR模型。1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg,i.p.)麻醉小鼠,橡皮筋綁扎雙側(cè)后肢根部阻斷肢體血流,誘導(dǎo)局部缺血2 h,然后去除橡皮筋恢復(fù)血液灌注。再灌注后4 h,取血處死小鼠。每組18只小鼠中,6只小鼠左肺用于檢測(cè)肺組織的濕/干重比(Wet-to-Dry,W/D),右肺用4%多聚甲醛固定,用于組織學(xué)分析;6只小鼠的肺組織樣本-80℃保存,用于檢測(cè)RAS組分的表達(dá);6只小鼠進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,對(duì)灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白濃度測(cè)定和炎性因子分析。

1.2.3 肺組織臟器系數(shù)與濕/干重比值(W/D)測(cè)定

小鼠處死后,電子天平稱體重(靈敏度為0.01 g);開胸分離雙側(cè)肺,濾紙輕輕吸干表面血液;分析天平(靈敏度為0.0001 g)稱量?jī)煞渭白蠓沃亓?濕重);將左肺放入真空干燥箱中(60℃)72 h后,重新稱取左肺重量(干重)。肺組織臟器系數(shù)=兩肺樣本的濕重/體重×100%;肺組織W/D=左肺濕重/干重。

1.2.4 肺組織學(xué)分析

小鼠右肺組織在4%多聚甲醛中固定24 h,常規(guī)石蠟切片,蘇木精和伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織學(xué)變化,并評(píng)估肺損傷程度。主要基于以下指標(biāo)分析每個(gè)樣本的病變程度:(1)肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血;(2)肺泡出血;(3)肺泡壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn);(4)肺泡間質(zhì)增厚/水腫。每個(gè)指標(biāo)分為5個(gè)等級(jí):0分(無損傷),1分(輕度損傷,損傷范圍≤25%/視野),2分(中度損傷,損傷范圍26%～50%/視野),3分(重度損傷,損傷范圍51%～75%/視野),4分(極重度損傷,損傷范圍76%～100%/視野)。對(duì)4項(xiàng)指標(biāo)的分?jǐn)?shù)求和,取隨機(jī)10個(gè)視野的平均值作為最終結(jié)果[14]。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)肺組織Ang II和Ang-(1-7)濃度

適量肺組織剪碎,在磷酸鹽緩沖液(PBS,1 mL/100 mg)中勻漿;勻漿液置于-20℃,經(jīng)過兩次凍融后,3000 r/min,4℃離心20 min,取上清。按照ELISA試劑盒使用說明操作。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算肺組織樣本Ang II和Ang-(1-7)的濃度。

1.2.6 肺泡灌洗液收集與分析

1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,仰臥位固定,頸部正中切開皮膚,分離氣管,在甲狀軟骨下約0.2 cm插入20 g鈍針頭,結(jié)扎氣管和針頭,1 mL預(yù)冷PBS注入肺組織,停留1 min后吸出灌洗液,反復(fù)抽吸3次留存;重復(fù)此步驟3次,混合3次灌洗液,4℃1500 r/min離心10 min,分離上清和沉淀。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)沉淀中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照試劑盒說明書,BCA法檢測(cè)上清液中蛋白濃度;ELISA法檢測(cè)IL-6和TNF-α的濃度。

1.2.7 肺組織總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)ACE/ACE2的mRNA表達(dá)水平

適量肺組織在液氮中研磨,使用TRIzol試劑提取肺組織總 RNA,NANO Drop 2000C Spectrophotometer測(cè)定RNA濃度和純度。以2μg RNA為模板,按照逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明操作合成cDNA。以cDNA為模板,進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增;根據(jù)相應(yīng)樣本中β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的Ct值,用2-△△Ct表示樣本結(jié)果。引物序列:ACE sense,5′-CAGTGTCTACCCCCAAGCAT-3′,ACE antisense,5′-CTTCCATCAAAGACCCTCCA-3′[14];ACE2 sense,5′-CCTTCTCAGCCTTGTTGCTGTTAC-3′,ACE2 antisense,5′-TGCCCAGAGCCTAGAGTTGTAGTC-3′[15]; β-actin sense,5′-GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3′;and β-actin antisense,5′-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3′[14]。反應(yīng)條件為:94℃2 min,隨后94℃15 s,60℃30 s,共40個(gè)循環(huán)。

1.2.8 Western Blot檢測(cè)肺組織ACE/ACE2與AT1/Mas受體蛋白表達(dá)

稱取肺組織,加入含有1%蛋白酶抑制劑的冷RIPA裂解液(1 mL/100 mg),冰上超聲勻漿,裂解物12 000 r/min,4℃離心20 min,取上清。BCA法檢測(cè)蛋白濃度。用RIPA裂解液調(diào)整樣本蛋白濃度至5μg/μL,按照1∶4比例與5×上樣緩沖液混勻,100℃加熱10 min。30μg蛋白用于10%SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳;90 V恒壓轉(zhuǎn)膜(PVDF膜);5%脫脂奶粉封閉1 h,孵育ACE(1∶1000稀釋)、ACE2(1∶1000稀釋)、AT1(1∶1000稀釋)和Mas(1∶300稀釋)一抗4℃過夜;次日HRP標(biāo)記二抗37℃孵育1 h;ECL顯影;Image J分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),進(jìn)一步兩兩比較采用Least Significant Difference(LSD)檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)ACE2基因減輕小鼠肺組織學(xué)變化

肉眼觀,野生對(duì)照(Control)和ACE2對(duì)照組(ACE2+Control)小鼠肺組織顏色粉紅有彈性;經(jīng)過肢體缺血再灌注處理的小鼠肺體積增大,呈暗紅色,尤以野生模型組(Model)最為明顯。光鏡下HE染色結(jié)果顯示(圖1A),野生和ACE2對(duì)照組小鼠,肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,無明顯充血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。野生模型組小鼠肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血,偶可見出血,肺泡腔內(nèi)及肺泡壁大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡間質(zhì)增厚、水腫。ACE2模型組(ACE2+Model)小鼠肺組織病理學(xué)變化較輕。然而,給予A779(ACE2+Model+A779)和MLN-4760(ACE2+Model+MLN-4760)干預(yù)后再進(jìn)行LIR處理,加劇了LIR對(duì)ACE2小鼠肺組織的損傷程度。進(jìn)一步進(jìn)行肺損傷評(píng)分,如圖1B顯示,野生對(duì)照和ACE2對(duì)照組肺損傷評(píng)分無顯著差異。與野生對(duì)照組相比,野生模型組肺損傷評(píng)分明顯升高(P<0.01);ACE2模型組較野生模型組評(píng)分顯著減低(P<0.01),而A779和MLN-4760處理后ACE2模型組肺損傷評(píng)分增加(P<0.01)。

2.2 過表達(dá)ACE2基因降低小鼠肺泡毛細(xì)血管通透性

如圖2所示,與野生對(duì)照組相比,野生模型組小鼠肺組織臟器系數(shù)(圖2A)、W/D比值(圖2B),肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖2C)和蛋白濃度(圖2D)明顯升高(P<0.01);與ACE2對(duì)照組相比,ACE2模型組各項(xiàng)指標(biāo)僅輕度升高(P<0.05),且較野生模型組顯著降低(P<0.01,P<0.05);給予MLN-4760和A779干預(yù)后,各指標(biāo)又較ACE2模型組明顯升高(P<0.05,P<0.01)。

2.3 過表達(dá)ACE2基因降低小鼠BALF炎性細(xì)胞因子表達(dá)

如圖3所示,與野生對(duì)照組相比,野生模型組小鼠肺泡灌洗液中IL-6(圖3A)和TNF-α(圖3B)表達(dá)明顯升高(P<0.01);與ACE2對(duì)照組相比,ACE2模型組肺泡灌洗液中兩炎性因子濃度僅輕微升高(IL-6,P>0.05;TNF-α,P<0.05),且較野生模型組顯著降低(P<0.01);A779和MLN-4760干預(yù),取消了過表達(dá)ACE2的作用,IL-6和TNF-α表達(dá)較ACE2模型組升高(P<0.05)。

圖1 過表達(dá)ACE2基因減輕小鼠肺組織學(xué)變化(±s,n=6)Note.A,Pathological changes in the lungs of ACE2 transgenic mice subjected to limb ischemia-reperfusion.HE staining,magnification of×40 and×200.B,Lung injury score:semi-quantitative pathological analysis based on HE staining.?P<0.05,??P<0.01.Figure 1 Overexpression of ACE2 attenuates lung injury in mice(±s,n=6)

圖2 過表達(dá)ACE2基因減輕小鼠肺泡毛細(xì)血管通透性(±s,n=6)Note.?P<0.05,??P<0.01.(The same in the following figures)Figure 2 Overexpression of ACE2 reduces the permeability of alveolar capillaries in mice(±s,n=6)

圖3 過表達(dá)ACE2基因降低小鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α表達(dá)(±s,n=6)Figure 3 Overexpression of ACE2 reduces the expression of IL-6 and TNF-αin the BALF in mice(±s,n=6)

2.4 過表達(dá)ACE2基因調(diào)節(jié)小鼠肺組織RAS表達(dá)

與野生對(duì)照組相比,野生型ICR小鼠LIR處理后,肺組織ACE2 mRNA(圖4A)和蛋白(圖5B)表達(dá)水平降低(P<0.01,P<0.05),ACE mRNA(圖4B)和蛋白(圖5C)表達(dá)水平升高(P<0.01)。ACE2對(duì)照組小鼠,肺組織ACE2 mRNA和蛋白水平較野生對(duì)照組明顯升高,經(jīng)過LIR處理后,ACE2(mRNA/蛋白)水平降低(P<0.05,P<0.01),ACE(mRNA,P<0.01/蛋白,P>0.05)水平升高。進(jìn)一步與野生模型組比較,二者變化較野生模型組明顯減輕(P<0.01,P<0.05)。A779和MLN-4760干預(yù)加劇了ACE2模型組的變化(P<0.01,P<0.05)。

結(jié)果提示,肢體缺血再灌注后,小鼠肺組織AT1(圖5D)和Mas(圖5E)蛋白表達(dá)同樣發(fā)生了變化。野生模型組和ACE2模型組AT1和Mas受體的蛋白表達(dá)均較相應(yīng)對(duì)照組增加(P<0.01,P<0.05);但ACE2模型組較野生模型組AT1水平更低(P<0.05),Mas水平更高(P<0.01)。應(yīng)用A779和MLN-4760使ACE2模型組小鼠肺組織Mas水平降低(P<0.01),AT1進(jìn)一步升高(P<0.01,P<0.05)。如圖5F所示,ACE2模型組AT1與Mas的比值低于野生模型組(P<0.05),藥物干預(yù)后比值升高(P<0.01)。且與ACE2對(duì)照組相比,AT1與Mas蛋白的比值在ACE2模型組略有降低(P>0.05)。

檢測(cè)肺組織ACE和ACE2的效應(yīng)分子Ang II和Ang-(1-7)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)效應(yīng)分子的變化與ACE和ACE2的變化不一致。野生模型組和ACE2模型組Ang II(圖6A)和Ang-(1-7)(圖6B)的濃度均較相應(yīng)對(duì)照組增加;但ACE2模型組較野生模型組AngII水平更低(P<0.05),Ang-(1-7)水平更高(P<0.01)。應(yīng)用A779和MLN-4760使ACE2模型組小鼠肺組織Ang-(1-7)水平降低(P<0.05,P<0.01),Ang II進(jìn)一步升高(P<0.05)。進(jìn)一步比較Ang II與Ang-(1-7)的比值發(fā)現(xiàn),ACE2模型組和藥物干預(yù)組的變化與相應(yīng)各組ACE蛋白水平的變化類似(圖6C)。

圖4 過表達(dá)ACE2基因調(diào)節(jié)小鼠肺組織ACE2和ACE mRNA表達(dá)(±s,n=6)Figure 4 Overexpression of ACE2 regulates lung mRNA levels of ACE2 and ACE in mice(±s,n=6)

圖5 過表達(dá)ACE2基因調(diào)節(jié)小鼠肺組織ACE2、ACE、AT1和Mas受體蛋白表達(dá)(±s,n=6)Figure 5 Overexpression of ACE2 regulates the protein expression of ACE2,ACE,AT1,and Mas in the lungs of mice(±s,n=6)

圖6 過表達(dá)ACE2基因調(diào)節(jié)小鼠肺組織Ang II和Ang-(1-7)表達(dá)(±s,n=6)Figure 6 Overexpression of ACE2 regulates lung Ang II and Ang-(1-7)in mice(±s,n=6)

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是人和動(dòng)物體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng),以循環(huán)和局部?jī)煞N形式,在調(diào)節(jié)血壓、水和電解質(zhì)平衡以及器官功能中發(fā)揮重要作用。近年來研究表明,肺組織局部RAS參與了急性肺損傷的發(fā)生與發(fā)展[7-9]。

研究結(jié)果表明,野生型和過表達(dá)ACE2基因小鼠在肢體缺血再灌注處理后均出現(xiàn)了典型的肺損傷的組織學(xué)表現(xiàn),肺組織臟器系數(shù)、濕/干重比值、BALF蛋白濃度和細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高,同時(shí)肺組織ACE、Ang II和AT1受體表達(dá)升高。這些結(jié)果提示ACE-Ang II-AT1軸的激活可能參與了LIR后小鼠急性肺損傷的病理過程。已有研究表明,ALI的早期主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,而Ang II是重要的血管損傷因子,Ang II的過度表達(dá)可通過AT1受體引起內(nèi)皮細(xì)胞腫脹和變性[14]。Ang II還可顯著誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致上皮屏障功能受損和通透性增加[16]。此外,增高的Ang II抑制肺泡上皮的鈉離子通道,誘導(dǎo)肺組織水通道蛋白1和水通道蛋白5的異常表達(dá)[17-18],引起肺泡壁通透性增加,液體清除率降低,導(dǎo)致肺水腫和滲出液中蛋白質(zhì)含量增加[7,17]。Ang II還刺激多種炎癥反應(yīng),激活炎癥因子,導(dǎo)致炎癥損傷。其中,IL-6和TNF-α已被動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)參與了急性肺損傷的發(fā)生與發(fā)展[19-20]。有學(xué)者認(rèn)為,早期檢測(cè)外周血IL-6和TNF-α水平可以預(yù)測(cè)急性胰腺炎引發(fā)的急性肺損傷的發(fā)生,并對(duì)評(píng)估急性肺損傷的嚴(yán)重程度和預(yù)后具有重要價(jià)值[21]。本研究結(jié)果也提示,在兩個(gè)基因型的模型組小鼠中,肺泡灌洗液IL-6和TNF-α濃度升高,尤以野生模型組升高更為明顯。

近年來,隨著ACE2的發(fā)現(xiàn),ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用越來越受到重視。研究表明,ACE2在肺泡上皮和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)[22-23]。ACE2能夠抑制炎癥損傷,從而保護(hù)肺組織免受損傷的影響[10,24-27];敲除小鼠ACE2基因會(huì)導(dǎo)致ACE/ACE2與Ang II/Ang-(1-7)穩(wěn)態(tài)失衡,加重肺部損傷[14],給予合成ACE2會(huì)顯著減輕肺組織病理變化[28]。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn),無論是外源性激活(DIZE干預(yù))還是內(nèi)源性高表達(dá)ACE2基因,均能減輕LIR誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷[13];而且,DIZE的作用可被特異性酶抑制劑MLN-4760和Mas受體阻斷劑A779所取消(文獻(xiàn)尚未發(fā)表)。在本研究中,LIR引起兩種基因型小鼠肺組織ACE、Ang II、AT1表達(dá)增加,ACE2表達(dá)減少,但與野生模型組相比,過表達(dá)ACE2基因顯著降低了模型組肺組織中ACE-AngII-AT1軸組分的變化幅度。此外,過表達(dá)ACE2基因,還減輕了肺組織的病變程度,降低了肺泡毛細(xì)血管通透性,降低了肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α的表達(dá)。然而,ACE2的這些有益作用被MLN-4760和A779所消除。因此,可以推斷ACE2可能通過ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸調(diào)控RAS,進(jìn)而發(fā)揮對(duì)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用。

研究中我們還發(fā)現(xiàn),野生型和ACE2基因過表達(dá)小鼠LIR后,肺組織Ang-(1-7)和Mas受體的表達(dá)均增加,這與ACE2的結(jié)果變化不一致。這種不一致可以通過以下幾種原因解釋:(1)Ang-(1-7)除通過ACE2水解Ang II產(chǎn)生外,還可以通過其他代謝途徑生成,比如它可以通過中性內(nèi)肽酶(NEP)/脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP)的催化作用從Ang I產(chǎn)生,或者通過ACE/NEP從Ang-(1-9)中分離出來[29]。(2)在過表達(dá)ACE2基因小鼠中,肺組織ACE2 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于野生型小鼠[13-14],而LIR小鼠肺組織的Ang II水平也較高,因而為升高的ACE2提供了更多的底物,產(chǎn)生更多的Ang-(1-7)。(3)Ang-(1-7)升高會(huì)激活Mas受體并增加受體的表達(dá)[30],二者結(jié)合發(fā)揮對(duì)ALI的保護(hù)作用。盡管Ang-(1-7)和Mas受體的表達(dá)增加,但從模型組Ang II與Ang-(1-7)的比值,以及AT1/Mas的比值上看,兩個(gè)模型組Ang II/Ang-(1-7)的比值,以及野生模型組AT1/Mas的比值仍高于對(duì)照組,因此,LIR小鼠肺組織Ang-(1-7)的水平不足以完全對(duì)抗Ang II的致?lián)p傷作用,最終導(dǎo)致肺損傷。但與野生型小鼠相比,ACE2過表達(dá)小鼠肺組織ACE2和Ang-(1-7)水平較高,能夠更好的拮抗ACE-Ang IIAT1軸的作用,肺部損傷程度較輕。ACE2過表達(dá)模型組中ACE蛋白表達(dá)水平無明顯變化也證實(shí)了這一點(diǎn)。此外,有文獻(xiàn)報(bào)道,脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷的恢復(fù)時(shí)間為Ang-(1-7)干預(yù)后3 d,3 d后較高水平的Ang-(1-7)可能與Mas受體結(jié)合發(fā)揮保護(hù)作用[31]。而本研究觀察的是缺血再灌注后4 h肺組織RAS的變化,與文獻(xiàn)報(bào)道時(shí)間相比,還處于早期階段,Ang-(1-7)的保護(hù)作用還不能有效發(fā)揮。

總之,肺組織RAS穩(wěn)態(tài)失衡在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究證實(shí)了ACE2可通過激活A(yù)CE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸,改善RAS穩(wěn)態(tài)失衡,進(jìn)而減輕肢體缺血再灌注引發(fā)的急性肺損傷。因此,靶定ACE2對(duì)RAS穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié),可以作為治療急性肺損傷的有效策略。