王達(dá)洋徐筱青趙明鏡王顯?

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700;2.中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100700;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)心血管病研究所,北京 100700)

目前,心血管疾病仍然是人類健康的頭號(hào)殺手[1-2],而動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是急性心肌梗死、卒中等多種高危心血管疾病的病理生理基礎(chǔ)。構(gòu)建AS動(dòng)物模型(尤其是大動(dòng)物模型)對(duì)于AS相關(guān)的研究具有重要的意義,而在這一方面已有諸多的探索[3-5]。

在已知的造模方法中,球囊損傷法在AS動(dòng)物模型的構(gòu)建中常用。小型豬由于其心臟大小、冠狀動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)和生理特征與人非常相似,因而通過球囊損傷小型豬冠狀動(dòng)脈制備AS模型是認(rèn)可度很高的方法。球囊損傷法是一種血管內(nèi)介入手術(shù)。其思路是通過球囊對(duì)目標(biāo)位置血管內(nèi)膜進(jìn)行機(jī)械損傷,以模擬AS形成中“內(nèi)皮損傷”的過程[6]。手術(shù)操作方法為:動(dòng)物麻醉后,經(jīng)頸動(dòng)脈或股動(dòng)脈穿刺并置入鞘管,將球囊經(jīng)導(dǎo)絲置于目標(biāo)血管處,以球囊/血管直徑約1.3∶1的比例過度擴(kuò)張,或往復(fù)拖拽數(shù)次[7-8],以達(dá)到損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的目的。這一方法常和高脂飼喂聯(lián)合使用,從機(jī)制上模擬人類AS的形成。早在20世紀(jì)70年代,這一方法初次被采用[9];在之后的數(shù)十年內(nèi),國內(nèi)外已有多項(xiàng)研究采用這一方法[8,10-11];至今許多學(xué)者將其作為公認(rèn)的造模方法。

球囊損傷法能夠獲得廣泛的應(yīng)用,更得益與其構(gòu)建管腔狹窄的效率。在術(shù)后的數(shù)周至數(shù)月內(nèi),損傷部位即可出現(xiàn)高度的管腔狹窄[7,10];另一方面又可縮短昂貴的高脂飼喂所需的時(shí)間,從而極大節(jié)省了成本。此外,球囊損傷還可以“預(yù)定”斑塊形成的位置,從而引起特定的器官慢性缺血,這是單純高脂飼喂所不具備的優(yōu)勢(shì)。

然而球囊損傷法的上述優(yōu)勢(shì)使得其劣勢(shì)逐漸被忽略。除手術(shù)、麻醉易造成動(dòng)物死亡外,其主要的問題在于球囊損傷所構(gòu)建“AS斑塊”與真正的人AS斑塊存在組成成分上的差異,而結(jié)構(gòu)成分差異所反映出的機(jī)制上的差異則可能對(duì)基于這些模型的研究造成影響。這些差異難以通過冠脈造影發(fā)現(xiàn),但通過病理學(xué)方法進(jìn)行組織形態(tài)分析則可以對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分。

因此本研究擬通過對(duì)球囊拉傷法構(gòu)建小型豬AS模型的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索,提取文中AS病變的病理圖像信息進(jìn)行分析,對(duì)比其與人自發(fā)形成AS斑塊的差異,并探討其形成機(jī)制及對(duì)科學(xué)研究的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對(duì)象為單獨(dú)或聯(lián)合使用球囊損傷法構(gòu)建小型豬或普通家豬AS模型相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究,并對(duì)病理圖像進(jìn)行再評(píng)價(jià)。

1.2 方法

1.2.1 檢索方法

以中國知網(wǎng)、萬方、維普三大中文數(shù)據(jù)庫及PubMed、Web of Science數(shù)據(jù)庫作為資料來源。對(duì)“球囊損傷”、“動(dòng)脈粥樣硬化”、“模型”、“miniature swine”、“Balloon Injury”、“Atherosclerosis”等關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,檢索期限為建庫至2020年4月14日。

1.2.2 文獻(xiàn)篩選及標(biāo)準(zhǔn)

由2位研究者獨(dú)立篩選文獻(xiàn)并交叉核對(duì),如有分歧則咨詢第三方專家協(xié)助判斷,如無法獲得全文的與作者聯(lián)系予以補(bǔ)充。

對(duì)于檢索到的文獻(xiàn)按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行逐步篩選:(1)通過標(biāo)題及摘要,排除所有重復(fù)文獻(xiàn)及與構(gòu)建AS模型無關(guān)的文獻(xiàn);(2)排除重復(fù)文獻(xiàn),獲取全文并通讀;(3)排除器官離體實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn);(4)排除研究動(dòng)物不為家豬或小型豬文獻(xiàn);(5)排除造模方法不為球囊損傷的文獻(xiàn);(6)排除未提供冠狀動(dòng)脈病理圖像為的文獻(xiàn);(7)排除無法提供清晰彩色病理圖像的文獻(xiàn);(8)排除未提供僅采用球囊損傷一種手術(shù)法的病變圖像的研究;(9)排除同時(shí)合并其他除誘導(dǎo)高脂血癥以外的干預(yù)方式的研究;(10)排除使用相同圖像的文獻(xiàn)。

1.2.3 資料提取

對(duì)最終篩選的文獻(xiàn)進(jìn)行資料提取,包括:(1)文獻(xiàn)提供的病理圖像(不包括聯(lián)合其他手術(shù)法的圖像,如支架、線圈、加熱球囊、壁內(nèi)注射等),并根據(jù)所提供的圖像的特征進(jìn)行重新描述;(2)手術(shù)與取材的時(shí)間間隔;(3)研究使用的動(dòng)物品系;(4)研究采用的其他造模輔助方法。

1.2.4 病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)

判斷膠原纖維、蛋白聚糖和SMC參考以下診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]:在Masson Trichrome染色(簡(jiǎn)稱Masson染色)下膠原纖維藍(lán)染,SMC紅染;在Movat Pentachrome(Movat五色套染)染色下膠原纖維黃染,蛋白聚糖藍(lán)-綠染,SMC紅染;在Azan染色下,膠原纖維藍(lán)色,肌纖維橘紅-紅染;Elastin Van Gieson(EVG)染色下膠原纖維紅染;肌纖維呈黃染。對(duì)每張病理圖片中AS斑塊構(gòu)成成分進(jìn)行判斷,分為“+”:肯定存在;“-”:肯定不存在;“+-”可能存在(病理特征不典型但不能排除);“○”:根據(jù)提供的切片及染色方法無法進(jìn)行判斷。

1.2.5 偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

使用SYRCLE動(dòng)物實(shí)驗(yàn)偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具[13]對(duì)納入的文獻(xiàn)進(jìn)行偏倚風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用基于病理圖像的文獻(xiàn)系統(tǒng)評(píng)價(jià)方法。由于這一方法不能反映各項(xiàng)研究的權(quán)重,因此不進(jìn)行數(shù)據(jù)合并Meta分析,僅對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

2.1.1 文獻(xiàn)篩選結(jié)果

從五大數(shù)據(jù)庫中共檢索到文獻(xiàn)878篇;去除重復(fù)文獻(xiàn)139篇,剩余739篇;根據(jù)題目及摘要,去除與冠狀動(dòng)脈球囊成形術(shù)無關(guān)的文獻(xiàn)489篇,剩余250篇;去除無法提供清晰彩色病理圖像的文獻(xiàn)180篇,剩余70篇;去除合并使用其他手術(shù)法(如壁內(nèi)注射)或干預(yù)(如病毒轉(zhuǎn)染)且未提供僅采用球囊損傷一種手術(shù)法和(或)僅采用高脂飼喂一種干預(yù)方法的病變彩色病理圖像的文獻(xiàn)32篇,剩余38篇。

2.1.2 納入文獻(xiàn)信息總覽

在納入的38篇文獻(xiàn)中,中文3篇,英文35篇;取材時(shí)間為手術(shù)后2～52周,大部分文獻(xiàn)為術(shù)后4周;10篇文獻(xiàn)同時(shí)聯(lián)用高脂飼喂法進(jìn)行AS的造模,其余文獻(xiàn)均采用單一的球囊損傷;僅有5篇文獻(xiàn)采用單一的H&E染色,其余文獻(xiàn)合并使用Masson、EVG、Movat五色套染、α-SMA免疫組化、天狼星紅染色等方法中的一種或多種進(jìn)行組織學(xué)染色。

2.2 各研究中病理圖像組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

2.2.1 球囊損傷病變與人類AS組織形態(tài)的相似性

在納入的所有研究中,大多數(shù)研究提供的圖像與人類AS病變?cè)谛螒B(tài)學(xué)上具有明顯的差異。具體表現(xiàn)為:可見管腔狹窄,主要以新生內(nèi)膜為主;內(nèi)側(cè)彈力版斷裂,纖維帽及脂質(zhì)核心不可見;新生內(nèi)膜主要構(gòu)成為平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell,SMC)及蛋白聚糖。僅有1項(xiàng)研究提供的圖像類似于人類AS病變,達(dá)到AHA IV期;但與人類典型的晚期AS病變形態(tài)“成熟纖維帽覆蓋有脂質(zhì)核心”的特征相比仍有較大差異。

在納入的所有38項(xiàng)研究提供的病理圖像中,病變的形態(tài)學(xué)基本一致,即:管腔存在中至重度狹窄,狹窄主要由新生內(nèi)膜引起;新生內(nèi)膜處內(nèi)側(cè)彈力板可見斷裂;纖維帽、壞死核心及細(xì)胞外脂質(zhì)不可見。病理特征統(tǒng)計(jì)信息(表1)。

2.2.2 新生內(nèi)膜的構(gòu)成分析

表1 納入研究的圖像病理特征統(tǒng)計(jì)Table 1 Description of morphological features of images included

由于在H&E染色下新生內(nèi)膜的成分難以區(qū)分,因此通過觀察使用EVG、Masson、Movat五色套染的病理切片(34項(xiàng)研究),分析新生內(nèi)膜的構(gòu)成,結(jié)果提示新生內(nèi)膜中平滑肌細(xì)胞、膠原纖維及蛋白聚糖均勻混合,膠原成分多于或少于中膜(使用中膜作為參照);蛋白聚糖成分顯著多于膠原成分(表2)。

表2 新生內(nèi)膜構(gòu)成成分的分析Table 2 Analysis of structure of neointimal hyperplasia

2.2.3 新生內(nèi)膜中膠原成分的分析

在納入的研究中有4項(xiàng)研究采用了天狼星紅染色,1項(xiàng)(Iso 2006)未進(jìn)行偏振光檢驗(yàn),2項(xiàng)研究的病理圖像顯示新生內(nèi)膜中膠原成分以III型膠原為主,1項(xiàng)顯示以I型膠原為主。

2.2.4 高脂飼喂對(duì)球囊損傷后的病理形態(tài)特征的影響

在納入的研究中共有10項(xiàng)研究采用聯(lián)合高脂飼喂法構(gòu)建AS模型,這些研究大多進(jìn)行手術(shù)至取材的時(shí)間間隔較長(zhǎng)。在這些研究中,除未提供完整血管橫截面的2項(xiàng)研究外,其余均存在管腔狹窄,5項(xiàng)研究狹窄大于等于75%;有5項(xiàng)存在(或可能存在)胞外脂質(zhì)沉積,2項(xiàng)存在(或可能存在)壞死核心,2項(xiàng)存在(或可能存在)纖維帽;1項(xiàng)類似于典型的AS病變(見表3)。

表3 高脂飼喂+球囊拉傷病理學(xué)特征統(tǒng)計(jì)Table 3 Description of morphological features of lesions induced by high-cholesterol diet&balloon injury

2.3 偏倚風(fēng)險(xiǎn)

所有研究均提及動(dòng)物的隨機(jī)分組,但未闡明具體方法,因此選擇性偏倚為“不確定”;研究均未提及對(duì)研究者施盲,故實(shí)施偏倚為“不確定”;所有研究均對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行測(cè)量評(píng)估,但由于論文篇幅論文無法提供所有病理切片的圖像,故測(cè)量偏倚為“不確定”;所有研究均未選擇性報(bào)告結(jié)果,故不存在報(bào)告偏倚;33項(xiàng)研究采用單純球囊損傷(或聯(lián)合高脂飼喂)作為對(duì)照組,36項(xiàng)研究的研究目的非探索新生內(nèi)膜的病理形態(tài),因此發(fā)表偏倚風(fēng)險(xiǎn)較低。

3 討論

3.1 球囊損傷病變與人類AS形態(tài)的差異

本研究認(rèn)發(fā)現(xiàn),由球囊損傷引起的冠狀動(dòng)脈病變具有以下形態(tài)學(xué)特征:血管內(nèi)膜顯著增生;增生內(nèi)膜的主要成分為平滑肌細(xì)胞和蛋白聚糖,而膠原成分相對(duì)減少;內(nèi)側(cè)彈力板斷裂常見;除非使用家族性高脂血癥動(dòng)物或長(zhǎng)期高脂飼喂,否則難以見到脂質(zhì)核心及纖維帽。

這一結(jié)果顯著區(qū)別于臨床中典型的AS。根據(jù)AS分類的AHA分期及分類標(biāo)準(zhǔn),其結(jié)締組織成分似III型病變,但其管腔狹窄達(dá)到V型病變程度;富含脂質(zhì)的Va型病變是冠狀動(dòng)脈中最典型的病變,而這類病變很少見到脂質(zhì)核心的形成;含脂質(zhì)較少的Vc型病變主要由膠原纖維構(gòu)成,又主要見于下肢動(dòng)脈[14-15],而這一病變膠原成分相對(duì)較少。因此這類病變難以劃分為AHA標(biāo)準(zhǔn)中的任何一類。

3.2 球囊損傷病變與AS機(jī)制的差異

球囊損傷病變并不符合典型的AS病變?nèi)我粫r(shí)期的特征,可能反映了這一病變?cè)谛纬蓹C(jī)制上與AS的差異。在所有納入的病理圖像中,97%切片均可見內(nèi)側(cè)彈力板(internal elastic lamina,IEL)斷裂,由此猜想球囊損傷導(dǎo)致內(nèi)膜增厚的主因是球囊拉傷引起的血管應(yīng)力改變,導(dǎo)致中膜平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變,由收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋潮硇?由中膜遷移至內(nèi)膜,大量增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)(其主要成分為蛋白聚糖);而冠狀動(dòng)脈作為彈力肌型動(dòng)脈,其IEL相對(duì)薄弱,在球囊的過度擴(kuò)張及拖拽下極易斷裂,斷裂的IEL又有助于活化的SMC遷移到內(nèi)膜區(qū);大量活化的SMC在內(nèi)膜區(qū)域快速增殖,分泌細(xì)胞外基質(zhì),因此形成了以SMC及蛋白聚糖為主要成分的內(nèi)膜增生,導(dǎo)致管腔高度狹窄。

球囊損傷病變?nèi)狈χ|(zhì)核心的原因在于:脂質(zhì)核心主要由泡沫細(xì)胞崩解形成,而短期(數(shù)周)的高脂飼喂,在代謝正常的動(dòng)物體內(nèi)無法引起足夠的脂質(zhì)在管壁沉積,而長(zhǎng)期(長(zhǎng)達(dá)1至3年[16-17])高脂飼喂或使用患有脂類代謝異常遺傳病的動(dòng)物[7,11,18],則可以產(chǎn)生具有壞死核心的典型AS(AHA IV型)病變。

球囊損傷病變纖維帽少見的原因?yàn)?AS纖維帽的形成機(jī)制是被激活的SMC及成纖維細(xì)胞大量分泌膠原,隨著炎癥反應(yīng)由斑塊表面逐漸向深部發(fā)展,SMC崩解壞死而膠原纖維則沉積在斑塊表面(即管腔一側(cè)),但這一過程十分漫長(zhǎng);同時(shí)當(dāng)沉積的膠原纖維出現(xiàn)侵蝕時(shí)可在侵蝕部位形成血栓,被機(jī)化后的血栓[14]及外源成纖維細(xì)胞[19]也參與了纖維帽的構(gòu)成。而球囊損傷后短期內(nèi)難以具備上述形成纖維帽形成的條件。但在一些長(zhǎng)期的研究中可以見到膠原纖維向斑塊表面沉積的趨勢(shì)。

3.3 對(duì)科學(xué)研究的影響

構(gòu)建AS動(dòng)物模型的目的主要為機(jī)制研究、藥理學(xué)研究、藥效評(píng)價(jià)及介入器械評(píng)價(jià)。球囊損傷法構(gòu)建的病變存在機(jī)制和形態(tài)學(xué)上的差異,對(duì)于上述研究可能會(huì)存在影響。比如,由于球囊損傷病變不存在細(xì)胞外脂質(zhì)及壞死核心,而氧化低密度脂蛋白是AS形成中重要的致炎因素[20],球囊損傷病變的炎癥水平可能遠(yuǎn)低于晚期AS,因此該模型可能不適用于AS形成的脂質(zhì)機(jī)制研究。另一方面,由于球囊損傷模型的新生內(nèi)膜主要由蛋白聚糖和SMC為主,與典型的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊相比具有較高的韌度,在支架部署時(shí)更易發(fā)生貼壁不良,因此理論上具有更高程度的支架內(nèi)再狹窄及支架血栓的發(fā)生率[21],從而可能對(duì)介入器械的評(píng)價(jià)造成一定的影響。因此將球囊損傷病變作為“AS”病變而進(jìn)行研究,可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果造成不可預(yù)測(cè)的偏差。

4 結(jié)論

球囊損傷導(dǎo)致的內(nèi)膜增生形態(tài)學(xué)上的具體表現(xiàn)為:血管內(nèi)膜顯著增生;增生內(nèi)膜的主要成分為平滑肌細(xì)胞和蛋白聚糖,而膠原成分相對(duì)減少;內(nèi)側(cè)彈力板斷裂常見。這一特征與AS的“纖維帽覆蓋脂質(zhì)核心”的特征具有顯著差異。兩種病變形態(tài)上的差異反映出機(jī)制上的差異,以該模型作為AS模型應(yīng)用于脂質(zhì)機(jī)制研究及臨床前評(píng)價(jià)應(yīng)慎重。