劉美怡錢深思容蓉楊勇?

(1.山東中醫(yī)藥大學,濟南 250355;2.山東中醫(yī)藥大學,中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心,濟南 250355)

免疫力是指機體在生存發(fā)展過程中所形成的識別“自我”與“非己”,并排斥“非己”而保護“自我”的能力,即機體自身的防御機制。免疫力低下包括因長期生活作息不規(guī)律或某些原發(fā)疾病等所致的機體免疫功能下降,還包括老年人的免疫系統(tǒng)功能性衰退而表現(xiàn)出的免疫低下狀態(tài)。當免疫機能下降,機體容易處于亞健康狀態(tài),更容易受到致病因子的侵襲,因此,建立能反映免疫低下特點并可重復、穩(wěn)定的動物模型將對開展相關(guān)疾病的防控具有十分重要意義。本綜述主要介紹免疫低下模型的實驗動物、建模方法、評價指標及其在中醫(yī)證候模型中的應(yīng)用,為今后選擇合適的免疫低下動物模型開展疾病發(fā)病機制、藥物評價等研究提供參考。

1 免疫低下動物模型分類

免疫低下模型動物按照獲得方式不同可分為先天性免疫低下和后天繼發(fā)性免疫低下,前者為先天遺傳性缺陷病所致,后者則主要是由惡性腫瘤、病毒、藥物、營養(yǎng)不良等所致。

1.1 先天性免疫低下動物模型

先天遺傳性免疫損傷常見于以下模型:BALB/c-nu、C3H-nu、C57BL/6-nu、NIH-nu品系裸鼠以及La-sat品系等,是先天缺失一種或兩種免疫器官的模型動物;CBA/N、Beige、SCID及B-NSG品系等,是各類免疫細胞存在缺陷的小鼠模型;裸大鼠;SHR品系大鼠;還有C8αt-r缺損癥、C4缺損癥、C5缺損癥及C6缺損癥等補體缺損的免疫功能障礙動物模型[1]。這些模型動物普遍個體差異小,動物用量少,且由于多是基因改變,免疫學特性比較穩(wěn)定,免疫缺陷維持時間較長;但缺點是由于先天免疫低下,有些品系小鼠生命周期僅維持在8.5個月左右,不利于長期跟蹤實驗,繁殖力差,且價格大多昂貴,不利于廣泛開展使用。

1.2 后天繼發(fā)性免疫低下動物模型

模型建立多用小鼠、大鼠、家兔、雪貂、比格犬等動物。目前常采用物理、化學及輻射的方法建立免疫低下動物模型,雖然此法造成的免疫損傷是暫時的,但在可獲得性和經(jīng)濟性上,比先天免疫缺陷動物模型更具可操作性優(yōu)勢,本文將對此進行重點闡述。

2 后天繼發(fā)性免疫低下動物模型的建立及評價

2.1 強電刺激法

電刺激法多選用大鼠,給予10 min的足底電擊刺激(電流強度1.0 mA,共33次,時間間隔為15 s,每次持續(xù)3 s),進行為期14 d的造模。足底電擊可使其免疫受到抑制,IgG抗體水平降低[2]。此方法危險系數(shù)較高且不易操作,因此,現(xiàn)少有研究采用強電刺激法建立免疫低下動物模型。

2.2 輻射法

此法多采取3-6 Gy劑量的射線全身均勻照射小鼠或大鼠24 h來實現(xiàn),應(yīng)用最多的是60Co-γ射線和X射線。楊芳等[3]提供的方法為:40 cm×40 cm的照射視野,5 Gy劑量的X射線進行一次性全身照射,源皮距為100 cm。輻射法所致免疫低下模型多表現(xiàn)為體重下降、活動減少,脾和胸腺萎縮,T淋巴細胞亞群值改變[4],白細胞和淋巴細胞計數(shù)減少等[5]。張蓉等[6]認為輻射是一種毒邪,火熱熾盛易耗氣傷陰而氣血虧虛,現(xiàn)也有不少人采用輻射法制備動物模型來研究中醫(yī)證候。郭平等[7]用60Co-γ射線建立血虛證小鼠模型,免疫學指標降低的同時,也出現(xiàn)了血虛證的表現(xiàn)。輻射法致免疫低下動物模型多應(yīng)用于中醫(yī)藥抗輻射作用研究及保健食品對輻射損傷的輔助保護和免疫調(diào)節(jié)作用研究。此法對實驗室的要求較高,并且通過輻射法造模的動物生命周期會縮短[8],不適用于周期較長的實驗研究。

2.3 應(yīng)激法

應(yīng)激所致的肝郁脾虛可使正常免疫功能受阻,由此將應(yīng)激法用于構(gòu)建免疫低下模型。馬濤等[9]對Wistar大鼠施加束縛夾尾5 min、噪聲12 h、禁食禁水12 h等不可預(yù)見性刺激,進行56 d實驗,通過慢性應(yīng)激建立肝郁脾虛抑郁模型,發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)了炎癥反應(yīng),細胞因子IL-1β含量增加,IFN-γ、IL-2等則減少,脾細胞免疫功能受損。黃曉峰等[10]每天從17:00-9:00將C57BL/6小鼠(6～8周齡,雌性)置于錐形管中束縛限制其活動,重復5 d,通過慢性心理應(yīng)激也能抑制免疫功能。

2.4 手術(shù)切除法

手術(shù)切除法是指通過切除免疫器官來實現(xiàn)免疫低下,如脾切除模型的建立,方法如下:選擇6周齡雄性大鼠,麻醉備皮,沿左上腹旁正中進腹剪開1.5～2.0 cm大小的切口,結(jié)扎血管和脾蒂,摘除脾后縫合切口。術(shù)后免疫細胞活性減弱,CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均下降[11]。脾切除所致免疫低下狀態(tài)維持時間較長,適用范圍較廣。

2.5 免疫抑制劑法

2.5.1 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)

CTX腹腔注射是常用的免疫低下動物模型誘導方法。ICR小鼠、BALB/c小鼠、昆明小鼠、A/J小鼠、豚鼠和大鼠是常用的嚙齒類模型動物,此外還有家兔等哺乳類動物。CTX給藥劑量和時間是有效建立免疫低下模型重要的因素,文獻報道沒有統(tǒng)一的給藥劑量和時間標準。相比較之下,小鼠模型多為80 mg/kg連續(xù)3 d和40 mg/kg連續(xù)10 d腹腔注射給藥。有學者對比研究不同劑量CTX對SD大鼠的造模效果,通過綜合存活率和白細胞計數(shù)兩項指標得出:中劑量組(間隔3 d,第1天150 mg/kg,第4天100 mg/kg)是最佳的誘導劑量[12]。吳萌等[13]采用4個月兔齡的新西蘭大耳家兔,CTX劑量為28.75 mg/(kg·d),連續(xù)注射10 d,胸腺和脾指數(shù)明顯降低。

CTX建模后,動物的體重、精神狀況和自主活動量等表觀指標可初步反映動物的免疫功能狀況。進一步檢測發(fā)現(xiàn),脾和胸腺指數(shù)降低、白細胞減少、IL-2、IL-4等細胞因子含量下降、IgG、IgM血清抗體水平下降、脾淋巴細胞增殖能力下降、巨噬細胞吞噬功能減弱、CD4+和CD8+及其比值均下降[14-15]。碳廓清實驗是評估免疫水平的方法之一,尾靜脈注射墨水是碳廓清實驗最常用的方式,王紅梅等[16]還推薦了內(nèi)眥靜脈注射墨水的方法。

近些年來,CTX廣泛應(yīng)用于中藥復方和成分免疫調(diào)節(jié)作用研究的前期模型構(gòu)建,其引起的免疫抑制還可用于構(gòu)建中醫(yī)脾虛證[17]和血虛證[18]模型。

2.5.2 氫化可的松(hydrocortisone,HY)

HY可減弱免疫功能,SD大鼠或小鼠常作為此類方法的模型動物[19]。通常采用25 mg/(kg·d)的劑量,連續(xù)7 d皮下注射HY來建模。HY溶液一般現(xiàn)用現(xiàn)配,采用無水乙醇和生理鹽水(1∶5)溶解稀釋[20]。呂穎堅等[21]證實造模后小鼠NK細胞活性降低、巨噬細胞吞噬能力減弱,整體免疫水平降低。血清IL-6、TNF-α、IFN-γ、小腸SIgA、IgG及補體C3的含量也可用于評價HY是否造模成功[20]。

錢宏梁等[22]配置0.0375 mg/mL濃度的HY水溶液于飲水瓶供小鼠飲用,連續(xù)14 d,建立虛證小鼠模型。研究認為HY誘導的多是與脾、腎二臟有關(guān)的虛證[23-24],潘志強等[23]認為HY用于構(gòu)建虛證動物模型時,較之其構(gòu)建免疫低下模型,應(yīng)稍減給藥劑量和延長造模時間。

2.5.3 環(huán)孢素A(ciclosporin A,CsA)

CsA能有效抑制輔助性T淋巴細胞活性,抑制CD4+T細胞增殖,可用于構(gòu)建T細胞功能障礙免疫低下模型。夏琦等[25]采用0.2 mg/g劑量的CsA溶液,連續(xù)5 d腹腔注射,建立免疫低下小鼠模型。另有文獻報道了連續(xù)7 d注射30 mg/(kg·d)劑量CsA的可行方法[26]。由于艾滋病毒主要攻擊CD4+T細胞,所以環(huán)孢素A也用于免疫缺陷型動物模型的建立,且研究表明中劑量25 mg/(kg·d)為造模最佳劑量[27]。此法一般采用小鼠作為模型動物,灌胃、腹腔注射及肌內(nèi)注射這三種給藥途徑均能建立起免疫低下動物模型[26]。

2.5.4 其他免疫抑制劑

國外學者采用醋酸可的松(100 mg/kg)對A/J小鼠連續(xù)3 d皮下注射的方法[28],以及地塞米松處理BALB/c小鼠的方法[29],都成功建立了免疫低下模型。也有比格犬模型的報道,通過連續(xù)7 d口服潑尼松龍(3.0 mg/kg)建立免疫低下模型[30]。另有研究者將雪貂設(shè)做研究對象,采用口服免疫抑制劑混合物(20 mg/kg霉酚酸酯,0.5 mg/kg他克莫司和8 mg/kg潑尼松龍)的方法建模[31-32]。由于雪貂呼吸道的受體分布和人類十分相似,且會出現(xiàn)和人一樣的打噴嚏、流鼻涕等表現(xiàn),這些是其他模型動物所不具備的特點,被普遍認為是研究流感病毒的優(yōu)良模型。

2.6 其他藥物方法

2.6.1 腺嘌呤

腺嘌呤可用于構(gòu)建腎虛且免疫低下大鼠模型,需提前用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液助懸,配置成1.5%的腺嘌呤混懸液,SD大鼠經(jīng)連續(xù)56 d灌胃腺嘌呤懸液(150 mg/kg)后,NK細胞活性降低、腎形態(tài)異常、補體C3水平下降,脾淋巴細胞也受到影響[33]。李卓恒等[34]通過腺嘌呤成功復制了腎虛大鼠模型,用于腎精虧虛證和腎虛生殖功能損傷的研究。免疫低下與中醫(yī)腎虛證相關(guān)聯(lián),因此可通過建立免疫低下動物模型來研究中醫(yī)腎虛證,但腺嘌呤致腎虛證造模時間稍長。

2.6.2 利血平

利血平最初用于中醫(yī)脾虛證、肝郁脾虛證的建模,但其會造成模型動物腸道吸收功能受阻,蛋白質(zhì)合成不足,機體免疫功能下降,因此可用來構(gòu)建免疫低下模型?？赏ㄟ^對小鼠進行連續(xù)17 d的背部皮下注射利血平(10-4g/kg)來建模[35]。研究表明腹腔注射利血平(4 mg/kg)可成功建立大鼠抑郁模型,懸尾實驗、強迫游泳實驗、曠場實驗等可作為評價造模是否成功的判斷依據(jù)。造模后,胸腺和脾指數(shù)下降,炎性因子IL-1β和TNF-α水平升高[36],利血平所致脾虛證可進一步用于構(gòu)建免疫低下模型。

2.6.3 D-半乳糖(D-galactose,D-gal)

D-gal常作為致衰劑用于構(gòu)建衰老模型[37-38],但機體的衰老機制與免疫功能的變化息息相關(guān)[39],也有少數(shù)人采用D-gal致衰來間接構(gòu)建免疫低下模型。方法主要有兩種:小鼠采用125 mg/kg的劑量頸背部注射,連續(xù)45 d[40];大鼠采用350 mg/kg的劑量頸背部注射,連續(xù)42 d[41]。研究證實其可用于陽虛證和衰老腎虛模型的制備[41-42]。此法造模周期較長,文獻報道在6～8周左右。

3 免疫低下動物模型與中醫(yī)證候模型的關(guān)系

中醫(yī)證候模型是研究疾病發(fā)生發(fā)展及中醫(yī)藥作用機制的有效工具,是中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。中醫(yī)證候模型的建立無論是采用疾病模型、病因模型、病證結(jié)合模型等都與現(xiàn)代醫(yī)學的動物模型評價緊密相關(guān)。已有研究證實,肝郁證、脾虛證、肝郁脾虛證和腎陽虛證候與現(xiàn)代醫(yī)學的免疫低下有一定關(guān)系,都不同程度地抑制了機體免疫[43-46]。現(xiàn)將免疫低下模型和中醫(yī)證候模型相關(guān)聯(lián),主要包括:腎虛證、肝郁脾虛證、血虛證等(表1,2)。

4 討論

目前國內(nèi)外建立免疫低下動物模型的方法有很多,各有優(yōu)缺點。但無論采用何種方法建模,都很難保證實驗中能同時抑制模型動物的所有免疫學指標,僅能保證選擇合適的方法、藥物、劑量和時間點,來影響模型動物的部分免疫學指標[48]。常用到的動物有小鼠、大鼠、新西蘭大耳家兔及雪貂等,但實驗選擇中最常見的還是小鼠,這與小鼠在可操作性和經(jīng)濟性上表現(xiàn)出的優(yōu)勢有關(guān)。檢測指標可包括:模型動物的宏觀指標(體重、攝食進水量、自主活動等)、臟器(胸腺、脾)指數(shù)、動物存活率、血常規(guī)水平、各細胞因子含量與所占比例以及T淋巴細胞亞群值等。這些都是在免疫力低下模型研究中可借鑒和參考的方法。

表1 免疫低下模型與中醫(yī)證候模型的關(guān)聯(lián)Table 1 Correlation between immunocompromised models and traditional Chinese medicine syndrome models

表2 免疫低下模型在中醫(yī)證候中的應(yīng)用Table 2 Application of immunocompromised models in traditional Chinese medicine syndrome models

中醫(yī)藥具有整合調(diào)節(jié)、扶正祛邪的作用,其多成分、多靶點、多環(huán)節(jié)的綜合治療能夠較好地改善機體亞健康狀態(tài),中醫(yī)藥在治療免疫力低下這類疾病方面具有獨特的優(yōu)勢。“免疫力低下”雖然是西醫(yī)的病名,應(yīng)用到中醫(yī)、中藥的現(xiàn)代研究就必然要涉及到中醫(yī)證候的定位及病證結(jié)合模型的研究。我們認為可以在以下兩個方面找到結(jié)合點:一是借鑒中醫(yī)證候的造模方法,再結(jié)合免疫低下造模的手段,綜合評價復合模型的中醫(yī)證候指標及微觀免疫學指標;另一方面是以現(xiàn)有的免疫低下造模方法為主體,擴展中醫(yī)證候的評價指標,以已有成熟的某種免疫低下造模方法來模擬某類中醫(yī)證候模型的評價模式。這種病證結(jié)合模型研究將遵循中醫(yī)理論指導的基本原則,既符合傳統(tǒng)的評價體系,又能結(jié)合現(xiàn)代免疫學進展的技術(shù)和方法,深入探討中醫(yī)藥“扶正祛邪”、“正氣存內(nèi),邪不可干”等普適性治則治法的作用機理及藥物干預(yù)機制,將能極大地推動中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究進程。因此,我們認為已有免疫低下動物模型的再評價、免疫力低下復合證候模型的研究模式將是今后此類動物模型在中醫(yī)藥領(lǐng)域開展研究的一個重要方向。