彭國瑞李旭妮王秀麗李偉杰魏津馬欣張一幟田野劉博李建羅玉峰李俊平彭小兵?

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081;2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 100193)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥、食物中毒和創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌,廣泛分布于土壤環(huán)境和動物消化道。目前,我國使用的獸用產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗有羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗、羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活疫苗(黑疫),仔豬A、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病單價、二價滅活疫苗或是與大腸桿菌、諾魏氏梭菌等其他疫病組成的聯(lián)苗以及兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌病滅活疫苗等,制造這類滅活疫苗主要采用將相應血清型免疫原性良好的產(chǎn)氣莢膜梭菌接種適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)后,用甲醛溶液滅活脫毒制成,其中菌株的產(chǎn)毒能力是決定疫苗質(zhì)量的重要因素之一。

本文對用于獸用疫苗制造和檢驗用C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種進行了復壯、分離培養(yǎng)、凍干制備,對所制備的菌種形態(tài)、生化、培養(yǎng)、血清學、毒力和免疫原性等生物學特性檢定方法進行了研究,為該菌種制備和檢定操作方法的規(guī)范提供了技術(shù)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

3周齡20只SPF級雌性CD-1(ICR)小鼠,體重16～18 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】;10只普通級雌性日本大耳白兔,80～100日齡,體重1.5～2.0 kg,購自北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心【SCXK(京)2019-0006】;2只普通肉用綿羊,1～2歲,購自河北滿城養(yǎng)殖場。試驗動物均飼養(yǎng)于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生物實驗基地【SYXK(京)2019-0011】。所有操作均符合中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所動物福利倫理審查要求(編號:中監(jiān)所(福)【2019】第00016號)。

1.1.2 實驗試劑

產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC60101(C59-1)株菌種(1960年7月30日凍干)由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保藏并提供。A、B、C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌定型血清由本實驗室保存,普通肉湯、普通瓊脂、肉肝胃酶消化湯、厭氣肉肝湯、醋酸鉛培養(yǎng)基、明膠緩沖液、石蕊牛奶培養(yǎng)基、蔗糖脫脂牛奶、明膠半固體培養(yǎng)基等購自北京中海生物科技有限公司,脫纖綿羊血購自北京索萊寶生物科技公司,細菌微量生化反應管購自杭州天和微生物試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的復壯

開啟產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC60101菌種,接種厭氣肉肝湯37℃培養(yǎng)24 h,轉(zhuǎn)接肉肝胃酶消化湯37℃培養(yǎng)13 h。取培養(yǎng)物2 mL左后肢股內(nèi)側(cè)肌肉注射綿羊,觀察1～2 d,死亡后立即剖檢,取心肌、肝、脾、腎、后肢肌肉等組織制作石蠟切片進行病理分析;同時取肝、心血、注射部位肌肉滲出液分別接種肉肝胃酶消化湯,37℃培養(yǎng)24 h,革蘭氏染色鏡檢[1]。

1.2.2 凍干菌種的制備

取死亡羊剖檢分離接種的肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)物分別接種厭氣肉肝湯、普通肉湯、普通瓊脂斜面,37℃培養(yǎng)24 h后,用肉肝胃酶消化湯擴大培養(yǎng),3000 r/min離心30 min,棄上清,在沉淀中加入蔗糖脫脂牛奶混勻,每支0.2～0.3 mL分裝安瓿,凍干封口,2～8℃保存。

1.2.3 真空度和剩余水分測定

新制備凍干菌種按照《中國獸藥典》(2015年版三部)規(guī)定測定真空度,隨機取真空度合格安瓿12支,分為4組,每組3支混合測定剩余水分含量。

1.2.4 純粹檢驗與培養(yǎng)特性檢定

新制備菌種5支開啟后,分別用普通肉湯溶解,接種厭氣肉肝湯、普通肉湯、普通瓊脂斜面、石蕊牛奶小管,37℃培養(yǎng)24 h。取厭氣肉肝湯培養(yǎng)物劃線接種含2%葡萄糖10%綿羊血的普通瓊脂平板,37℃厭氧培養(yǎng)24 h。

1.2.5 形態(tài)和生化特性檢定

取新制備菌種厭氣肉肝湯培養(yǎng)物進行革蘭氏染色鏡檢。同時接種明膠半固體培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基,另挑取約10μL分別接種糖發(fā)酵管,均37℃厭氧培養(yǎng)10 d。

1.2.6 小鼠毒力測定

新制備菌種厭氣肉肝湯培養(yǎng)物接種肉肝胃酶消化湯100 mL,37℃培養(yǎng)17 h。取20 mL 3000 r/min離心30 min,上清用0.22μm濾器過濾,分裝濾液,-70℃保存作為毒素備用。毒素冷水浴融化后,取0.5 mL加入9.5 mL明膠緩沖液20倍稀釋后,按比例稀釋,尾靜脈注射小鼠,每個滴度2只,每只0.2 mL,24 h后,測定小鼠1 MLD毒素原液量含量。

1.2.7 血清學特性檢定

取-70℃保存毒素加入1%胰酶,37℃作用1 h,3000 r/min離心30 min,取上清每只0.2 mL尾靜脈注射小鼠2只;另取毒素稀釋至3 MLD/0.2 mL,取A、B、C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌定型血清各0.3 mL分別加入0.6 mL毒素稀釋液中混勻,37℃作用45 min,每型血清中和物分別每只0.3 mL尾靜脈注射小鼠各2只;另取小鼠2只,每只0.2 mL尾靜脈注射3 MLD/0.2 mL毒素稀釋液作為對照,觀察24 h。

1.2.8 免疫原性檢定

(1)疫苗的制備與免疫

取新制備菌種肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)物60 mL,按0.75%加入甲醛溶液(40%),搖勻,37℃滅活脫毒12 d,每日振搖4次。滅活脫毒培養(yǎng)物分別接種厭氣肉肝湯小管、普通肉湯小管、普通瓊脂斜面小管各1支,37℃培養(yǎng)7 d,檢驗滅活效果;另取滅活脫毒培養(yǎng)物12 000 r/min離心15 min,取上清每只0.4 mL尾靜脈注射小鼠2只,觀察72 h,檢驗脫毒效果。將滅活脫毒完全的肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)物用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0,按5∶1(體積:質(zhì)量)加入滅菌氫氧化鋁膠佐劑充分混合作為疫苗,每只1.0 mL頸背部皮下注射日本大耳白兔4只,連同對照兔2只、測毒用兔7只在相同條件下飼養(yǎng)。

(2)毒力測定與攻毒

取-70℃保存毒素,冷水浴融化后,0.5 mL加入9.5 mL明膠緩沖液進行20倍稀釋后,按適當比例稀釋,耳緣靜脈注射測毒用兔,每只1.0 mL,觀察72 h,測定日本大耳白兔1 MLD毒素原液含量。免疫組日本大耳白兔免疫14 d后,取與測毒同批毒素0.5 mL加入9.5 mL明膠緩沖液進行20倍稀釋后,用1 MLD毒素每只1.0 mL耳緣靜脈注射攻毒,免疫組注射4只,對照注射2只,觀察5 d。

2 結(jié)果

2.1 菌種的復壯

注射羊1 d內(nèi)死亡,進行解剖。取心臟、肝、注射部位肌肉等組織制作石蠟切片進行病理分析,見較大面積組織壞死(黑色箭頭),淋巴細胞浸潤(紅色箭頭),大量細菌團塊(黃色箭頭)(見圖1)。接種注射部位肌肉滲出液、肝、心血的肉肝胃酶消化湯渾濁生長且產(chǎn)生大量氣體。涂片染色后顯微鏡下均可見呈紫色大桿菌,革蘭氏陽性,兩端鈍圓,菌形一致,單個散在或成雙或多個聚集分布,符合產(chǎn)氣莢膜梭菌特征。結(jié)果表明,產(chǎn)氣莢膜梭菌在攻毒綿羊體內(nèi)大量繁殖,引起組織病變,動物發(fā)生急性死亡。

圖1 組織病理學分析(HE染色,×400)Figure 1 Histopathological analysis(HE staining,×400)

2.2 凍干菌種的制備

取致死羊組織接種的肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)物,轉(zhuǎn)接厭氣肉肝湯,見渾濁生長且大量產(chǎn)氣、普通肉湯混濁生長、普通斜面不生長。經(jīng)擴大培養(yǎng)分裝凍干,共制備凍干菌種221支。

2.3 真空度和剩余水分測定

經(jīng)測定214/221支凍干菌種安瓿真空度均符合規(guī)定。剩余水分含量測定結(jié)果分別為1.5%、1.5%、1.5%、1.7%,均小于3%,符合規(guī)定。

2.4 純粹檢驗和培養(yǎng)特性檢定

所制備的菌種5/5在厭氣肉肝湯中純粹生長,培養(yǎng)4 h產(chǎn)生大量氣體,普通肉湯純粹混濁生長,普通瓊脂斜面不生長,在石蕊牛奶中爆性發(fā)酵;在血瓊脂表面上形成1～3 mm、半透明、灰白色、表面光滑、邊緣整齊的圓形菌落,呈現(xiàn)β、α雙溶血環(huán)。

2.5 形態(tài)和生化特性檢定

革蘭氏染色顯微鏡觀察,菌體呈紫色大桿菌,為革蘭氏陽性菌,兩端鈍圓,菌形一致,單個散在或成雙或多個聚集分布。使醋酸鉛培養(yǎng)基顏色變黑,明膠半固體培養(yǎng)基液化;接種糖發(fā)酵管10 d內(nèi)觀察,菌種形態(tài)和生化特性均符合產(chǎn)氣莢膜梭菌特征。

2.6 小鼠毒力測定

按表1稀釋毒素尾靜脈注射小鼠,觀察24 h。結(jié)果表明,小鼠1 MLD含0.00075 mL毒素原液,毒力達到《中國獸用生物制品規(guī)程》標準[1]。

2.7 血清學特性

毒素原液經(jīng)胰酶處理后,注射小鼠,未發(fā)生死亡,表明該菌種產(chǎn)生的毒素可以被胰酶破壞,因此不是B型或者D型產(chǎn)氣莢膜梭菌,為A型或者C型;血清中和實驗結(jié)果顯示,該菌種產(chǎn)生的毒素與A型和D型定型血清中和物注射小鼠全部死亡,與B型、C型定型血清中和物注射小鼠未發(fā)生死亡,表明B型和C型血清可以中和該菌種產(chǎn)生的毒素。綜上表明,該菌種為產(chǎn)氣莢膜梭菌C型。

2.8 免疫原性檢定

2.8.1 疫苗的制備與免疫

滅活脫毒培養(yǎng)物接種厭氣肉肝湯小管、普通肉湯小管、普通瓊脂斜面小管均無細菌生長。離心上清注射小鼠,未見死亡,表明培養(yǎng)物滅活脫毒完全,制成滅活鋁膠菌苗免疫日本大耳白兔4只,免疫期14 d內(nèi)均健活。

2.8.2 毒力測定

按表2方法稀釋毒素靜脈注射日本大耳白兔,結(jié)果表明,1 MLD為0.02 mL毒素原液。

2.8.3 免疫攻毒結(jié)果

按照測毒結(jié)果將毒素稀釋至每毫升含毒素原液0.02 mL,即日本大耳白兔1 MLD,耳緣靜脈注射免疫組和對照組,免疫組4/4保護,對照2/2死亡。表明,該菌種的免疫原性符合規(guī)定。

3 討論

C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素含有α、β毒素,B型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素含有α、β、ε毒素。其中,α、β毒素對胰酶敏感,胰酶處理可以使其完全失去活性;而ε毒素為前體毒素,需經(jīng)胰酶、糜蛋白酶等酶的活化,產(chǎn)生毒性[2-5]。若待檢菌種為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌,因其毒素中含有α、β毒素,經(jīng)胰酶處理后,失去毒性,注射小鼠應存活;若待檢菌種為B型產(chǎn)氣莢膜梭菌,因其毒素除含有α、β毒素外,還含有無毒性的ε毒素前體,經(jīng)胰酶處理后ε毒素前體被活化,產(chǎn)生毒性,注射小鼠應死亡。本研究結(jié)果顯示,待檢菌種毒素原液經(jīng)胰酶處理,注射小鼠,2/2存活;用未經(jīng)胰酶處理的毒素作為對照注射小鼠,2/2死亡。說明經(jīng)胰酶處理后,該毒素不表現(xiàn)毒性,故不含有ε毒素。綜上,可將待檢產(chǎn)氣莢膜梭菌判定為C型。

《中國獸用生物制品規(guī)程》中的《羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)、腸毒血癥三聯(lián)滅活疫苗制造及檢驗規(guī)程》僅規(guī)定用產(chǎn)氣莢膜梭菌定型血清做中和試驗檢查CVCC60101(C59-1)株為血清C型,而《產(chǎn)氣莢膜梭菌病定型血清制造及檢驗規(guī)程》也僅規(guī)定了中和試驗結(jié)果判定方法[1]。由于B型和C型血清都可以分別中和B型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素,A型和C型血清均不能中和這兩種毒素,因此,僅通過中和試驗不能對B型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的血清型做出區(qū)分,需采用測毒、胰酶處理和血清中和試驗三步進行檢定。

表1 小鼠毒力測定結(jié)果Table 1 Results of virulence testing by mice

表2 用兔測定毒力Table 2 Results of virulence testing by rabbits

目前,檢定生產(chǎn)檢驗用C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株主要依據(jù)《中國獸用生物制品規(guī)程》,該“規(guī)程”對菌種的形態(tài)和生化特性、培養(yǎng)特性、血清學特性、毒力、免疫原性以及純粹性作出了規(guī)定,但仍缺乏對菌種的制備以及檢定項目更為詳細的操作規(guī)范。本研究從菌種的易感動物復壯、凍干制備以及檢定操作方法等方面進行了研究,為進一步規(guī)范該菌種的制備、質(zhì)量檢定標準和操作方法提供了技術(shù)依據(jù)。