譚偉江李想鄭雙馬俊峰任學聰賀天真陳虹華陳建新?楊豐華?

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣州 510642;2.廣東省實驗動物監(jiān)測所,廣東省實驗動物重點實驗室,廣州 510633)

我國心血管病患者達到2.9億,死亡率居各疾病之首,已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。多種心血管疾病包括高血壓、瓣膜病、先天性主動脈狹窄均可導(dǎo)致左室壓力超負荷,誘發(fā)心室代償性肥厚、收縮舒張功能障礙,并進而發(fā)展為失代償性心衰[2]。壓力超負荷致心衰是基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學的研究重點。最早由Rockman等[3-4]報道應(yīng)用小鼠主動脈弓縮窄(TAC)手術(shù)來誘導(dǎo)壓力超負荷技術(shù),是最常用的心衰疾病機制研究和藥物研發(fā)的手術(shù)誘導(dǎo)模型之一。

目前在應(yīng)用TAC小鼠心衰模型中普遍只關(guān)注某個病理進程點,例如基于心肌肥厚[5-6]或心衰[7]的研究,缺乏對模型多個疾病進程結(jié)構(gòu)、功能和病理變化的完整探索。近年來隨著影像學技術(shù)的不斷發(fā)展,特別是超高頻高分辨小動物超聲影像系統(tǒng)的應(yīng)用,為無創(chuàng)、連續(xù)性動態(tài)檢測小鼠手術(shù)模型的心臟結(jié)構(gòu)和功能變化提供了可能[8-9]。在超聲影像數(shù)據(jù)采集中,較為常用的為B型超聲和M型超聲,其通過測量心臟室壁厚度,心室內(nèi)徑并計算射血分數(shù)和短軸縮短率來評價心臟結(jié)構(gòu)和收縮功能,但結(jié)合二尖瓣口血流多普勒和二尖瓣環(huán)組織多普勒評價心臟舒張功能的方法較為少用。除了影像學外,病理學技術(shù)也為深入了解模型病理變化提供了重要依據(jù)。本研究通過結(jié)合B型、M型、多普勒超聲影像學與病理組織學技術(shù),對小鼠壓力超負荷致心衰模型疾病進程做出綜合性評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

3月齡無特定病原體(SPF)級雄性C57BL/6J小鼠32只,體重(26±2)g,購買自廣東省醫(yī)學實驗動物中心【SCXK(粵)2018-0002】,飼養(yǎng)于廣東省實驗動物監(jiān)測所SPF級和AAALAC認證的動物設(shè)施【SYXK(粵)2016-0122】,飼養(yǎng)設(shè)施環(huán)境保持溫度22～26℃和濕度40%～60%,12 h日夜周期交替。實驗計劃由廣東省實驗動物監(jiān)測所實驗動物倫理委員會審核通過(IACUC2017015)。

1.1.2 試劑與儀器

異氟烷(瑞沃德,中國),直接紅80(Sigma,366648),苦味酸(Sigma,197378),伊紅(Sigma,14009)蘇木素(Sigma,104302),顯微鏡(Leica DM 2000,德國),Vevo2100超高頻高分辨小動物超聲影像系統(tǒng)(VisualSonics,加拿大)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

32只小鼠隨機分為手術(shù)造模前0周(n=8)和手術(shù)造模后2周(n=8)、4周(n=8)、8周(n=8)組。實驗總體設(shè)計見圖1。

圖1 小鼠心衰模型建模和實驗設(shè)計Note.A,The overall design of the experiment.B,Surgery thoracotomy.C,Schematic diagram of establishment of TAC model in mice.Blue,the needle for determining the constriction size.Figure 1 Model establishment and experimental design for the murine heart failure model

1.2.2 小鼠壓力超負荷心衰模型制備

按已有報道所述建模[10-12],首先,使用2%異氟烷(瑞沃德)混合氣體對小鼠進行誘導(dǎo)麻醉,然后轉(zhuǎn)移至手術(shù)臺保定,行氣管插管后連接呼吸機,給予1.5%異氟烷混合氣體維持麻醉;其次,小鼠胸部進行消毒及備皮后,第二肋位做縱向切口打開胸腔,暴露主動脈胸段;最后,在主動脈的頭臂干與左頸總動脈間下方穿入7-0細線,把26 G細針與主動脈弓共同結(jié)扎,結(jié)扎后取出細針(圖1B,1C)。

1.2.3 主動脈弓血流多普勒超聲

主動脈弓血流參數(shù)通過多普勒超聲技術(shù)獲取。將超聲探頭放置于小鼠右側(cè)頸部位置,顯示主動脈弓圖像后,將多普勒取樣容積光標放到頭臂干與左側(cè)頸總動脈間的主動脈弓段,獲得主動脈血液峰值速度,結(jié)合多普勒效應(yīng)運算獲得血液峰值壓力。

1.2.4 M型和B型超聲

對實驗小鼠應(yīng)用Vevo 2100小動物超聲成像儀配合MS-400探頭進行B型和M型超聲測量。采用已報道的方法進行超聲檢測[13-15],使用1.5%異氟烷混合氣體對小鼠麻醉,取仰臥位保定,探頭切跡朝向小鼠右肩與中線成約30°取得水平位胸骨旁左室長軸B型圖;順時針旋轉(zhuǎn)探頭約90°,獲得乳頭肌平面的胸骨旁左室短軸B型圖,同時放置M型超聲光標,獲得左室M型超聲圖像。記錄室間隔收縮末期厚度(interventricular septum thickness,endsystolic,IVS;s),室間隔舒張末期厚度(interventricular septum thickness,end-diastolic,IVS;d),左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension,end-systolic,LVID;s),左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension,end-diastolic,LVID;d),左室收縮末期后壁厚度(left ventricular posterior wall,end systolic,LVPW;s)和左室舒張末期后壁厚度(left ventricular posterior wall,end diastolic,LVPW;d)。計算反映左室收縮功能指標包括射血分數(shù)(ejection fraction,EF)和短軸縮短率(short axis fractional shortening,FS)。

1.2.5 二尖瓣血流和組織多普勒頻譜采集

采集二尖瓣口血流和二尖瓣環(huán)組織多普勒頻譜用于評價心臟舒張功能。將探頭移動到胸廊的外側(cè)壁水平放置,得到心尖四腔切面。將多普勒取樣容積光標放置在二尖瓣瓣尖上方獲得二尖瓣口舒張早期血流E峰值速度和舒張晚期血流A峰值速度,等容收縮時間(isovolumetric contraction time,IVCT),等容舒張時間(isovolumetric relaxation time,IVRT),和射血時間(ejection time,ET)。使用如下公式計算心肌功能指數(shù)(myocardial performance index,MPI):MPI=(IVCT+IVRT)/ET。同時,在標準心尖四腔心切面,選取組織多普勒模式顯示完整二尖瓣環(huán)結(jié)構(gòu),容積光標至于左室前壁處獲得二尖瓣環(huán)運動頻譜。測量可獲得舒張早期瓣環(huán)e′峰值速度和舒張晚期瓣環(huán)a′峰值速度。

1.2.6 病理學評價

采集0、2、4、8周組小鼠心臟樣本,置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h,取心臟進行石蠟包埋,4μm厚度切片,HE染色觀察心肌細胞形態(tài)改變,天狼猩紅染色分析心肌纖維化程度。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標準差(±s)表示。采用多功能數(shù)據(jù)圖像分析軟件GraphPad Prism 7進行統(tǒng)計分析。結(jié)果采用One-way ANOVA單因素方差分析及Tukey’s檢驗比較0、2、4、8周組之間的指標值的差異。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 主動脈弓縮窄誘導(dǎo)左室壓力超負荷

血流多普勒用于檢測血流速度流向及速度(圖2)。在造模前0周和造模后2、4、8周對小鼠主動脈弓縮窄部位進行測量。超聲結(jié)果顯示,與0周組相比,2、4、8周組小鼠主動脈弓縮窄部位血流速度和壓力均顯著性增加。所有測量和計算值見表1。

表1 主動脈弓血流峰值速度及血流峰值壓力(±s,n=8)Table 1 Peak velocity and pressure at the aortic arch stenosis(±s,n=8)

表1 主動脈弓血流峰值速度及血流峰值壓力(±s,n=8)Table 1 Peak velocity and pressure at the aortic arch stenosis(±s,n=8)

注:與0周組比較,?P<0.05。Note.Compared with the 0 week group,?P<0.05.

組別Groups血流峰值速度(mm/s)Peak velocity(mm/s)血流峰值壓力(mmHg)Peak pressure(mmHg)0周0 week 689.42±45.92 1.91±0.26 2周2 weeks 4773.00±622.71? 92.48±23.25?4周4 weeks 4395.57±572.69? 78.43±21.21?8周8 weeks 4553.73±644.53? 84.40±25.03?

圖2 B型圖和血流多普勒頻譜Figure 2 B-mode and blood flow Doppler indices at the aortic arch stenosis

2.2 小鼠心衰病理進程中心臟結(jié)構(gòu)的改變

胸骨旁B型長軸和短軸以及M型超聲顯示造模后2、4、8周心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著性的階段性改變(圖3A)。與造模前0周組相比,造模后2周心臟室間隔(圖3A,3B)和左室后壁(圖3A,3D)在收縮和舒張末期均顯著性增厚,而左室內(nèi)徑顯著性縮小(圖3A,3C),表現(xiàn)為代償性心肌肥厚的結(jié)構(gòu)特征。隨著疾病進程進入過渡期,造模后4周的心臟室間隔和左室后壁收縮末期的代償性肥厚消失(圖3B,3D,紅線);同時,左室內(nèi)徑開始擴大,指標值由顯著性縮小恢復(fù)到與造模前0周組一致(圖3C)。當疾病發(fā)展至第8周時,室間隔和左室后壁進一步變薄,與2周組和4周組比較均有顯著性差異(圖3B,3D),在收縮期甚至顯著性低于造模前0周組(圖3B,3D,紅線)、在舒張期與造模前0周組接近(圖3B,3D,藍線);第8周內(nèi)徑進一步擴大,與2、4周均有顯著性差異(圖3C)。第8周的心臟結(jié)構(gòu)結(jié)果指示了擴張型心衰的結(jié)構(gòu)特征。所有測量和計算值見表2。

表2 心臟結(jié)構(gòu)測量值(±s,n=8)Table 2 Structural indices in the pathological process(±s,n=8)

表2 心臟結(jié)構(gòu)測量值(±s,n=8)Table 2 Structural indices in the pathological process(±s,n=8)

注:分別與0、2、4周組比較,?,#,&P<0.05。(下圖/表同)Note.Compared with 0 week,2 weeks,and 4 weeks respectively,?,#,&P<0.05.(The same in the following Figures and Tables)

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2.3 小鼠心衰病理進程中左室收縮功能變化特征

射血分數(shù)(圖4A)和短軸縮短率(圖4B)分別反映了左室心肌縮短和左室排空功能,是整體評價心臟收縮功能的兩個主要指標。結(jié)果顯示,與造模前相比,手術(shù)造模2周后,心臟射血分數(shù)和短軸縮短率顯著性升高,提示左室收縮功能因壓力超負荷導(dǎo)致代償性功能增強。4周時,心臟射血分數(shù)和短軸縮短率與2周時相比顯著性降低,但與造模前無顯著性差異,提示了左室代償性增加的收縮功能逐漸喪失。當疾病持續(xù)至8周,心臟射血分數(shù)和短軸縮短率進一步降低,與2,4周相比均有顯著性差異。另外,造模后小鼠心臟每搏輸出量持續(xù)性下降。綜上所述,在壓力超負荷誘導(dǎo)小鼠心衰的病理過程中,心臟收縮功能首先代償性增強,隨著疾病發(fā)展,心臟收縮功能不斷喪失,直至失代償。術(shù)后各周心臟射血分數(shù)和短軸縮短率值,見表3。

表3 心臟收縮功能測量值(±s,n=8)Table 3 Assessment results of the left ventricular systolic function(±s,n=8)

表3 心臟收縮功能測量值(±s,n=8)Table 3 Assessment results of the left ventricular systolic function(±s,n=8)

組別Groups心輸出量(mL/min)Cardiac output per beat(mL/min)射血分數(shù)(%)Ejection fraction,EF(%)短軸縮短率(%)Short axis fractional shortening,FS(%)0周0 week 17.46±1.86 66.08±2.68 35.84±1.91 2周2 weeks 16.56±2.52 77.44±5.97? 45.57±5.48?4周4 weeks 15.95±1.95 61.13±2.69# 32.31±1.89#8周8 weeks 13.66±2.46?# 35.89±2.48?#& 17.10±1.31?#&

圖3 病理進程中M-型和B-型超聲結(jié)果Note.A,Parasternal long-axis B-mode ultrasound,short-axis B-mode ultrasound,and short-axis M-mode ultrasound images of the left ventricle at 0,2,4,and 8 weeks,a-Left ventricular septal end-systolic thickness IVS;s and b-Left ventricular septal thickness IVS;d,c-Left ventricular endsystolic diameter LVID;s and d-Left ventricular end-diastolic diameter LVID;d,e-Left ventricular end-systolic thickness LVPW;s And f-Left ventricular end-diastolic thickness LVPW;d.B-D,end-systolic(red)and end-diastolic(blue)interventricular septal thickness,left ventricular diameter,and left ventricular posterior wall thickness.Compared with 0 week,2 weeks,and 4 weeks respectively,?,#,&P<0.05.Figure 3 B-mode and M-mode ultrasonic images in the pathological process

圖4 病理進程中左室收縮功能評價Figure 4 Systolic function of left ventricle in the pathological process

2.4 小鼠心衰病理進程中左室舒張功能的評價

采用二尖瓣口血流多普勒結(jié)合二尖瓣環(huán)組織多普勒整體評價左室的舒張功能(圖5A,表4,5)。血流多普勒結(jié)果顯示,與造模前比較,二尖瓣口血流等容收縮時間在2、4周有延長趨勢但無顯著性差異,8周顯著性延長,等容舒張時間在2、4、8周均顯著性延長;射血時間在各時間點均無顯著性改變。以上結(jié)果提示心功能受損。

二尖瓣口舒張早期血流E峰值速度在2、4周組顯著性下降,其中4周組有回升趨勢;E峰值流速8周組無顯著性改變。舒張晚期血流A峰值速度只在8周組顯著性下降。計算血流峰值速度比E/A,可見先下降,隨后回升到增加的趨勢,其中,2周組表現(xiàn)為顯著性下降、4周組表現(xiàn)為回升到接近正常值、8周組表現(xiàn)為顯著性上升(圖5B)。二尖瓣環(huán)組織多普勒e′和a′分別代表舒張早期和晚期的二尖瓣環(huán)運動速度(圖5A)。結(jié)果顯示,與0周相比,2、4、8周e′,a′及e′/a′均顯著性降低(圖5A,5B),表明心臟舒張功能受損。所有測量和計算值見表4,5。

結(jié)合二尖瓣血流多普勒結(jié)合二尖瓣環(huán)組織多普勒測量結(jié)果,分析E/e′值顯示,此指標0周與2、4、8周值均顯著性改變,表明三個心衰進程心臟舒張功能受損,并提示了4周過渡期的E/A值為假性正常(圖5B,表4,5)。

圖5 二尖瓣的血流多普勒和組織多普勒頻譜Note.A,0,2,4 and 8 weeks group mitral valve orifice blood flow Doppler and mitral valve annulus tissue Doppler spectrum.E-mitral peak E wave velocity in diastole,A-mitral peak A wave velocity in diastole,a-isovolumic contraction time,b-isovolumic relaxation time,c-ejection time.e′-mitral annular e′velocity in diastole,a-mitral annular e′velocity in diastole.B,The cardiac diastolic function changes during the pathological process.a,E/A,ratio of early diastolic blood flow peak E and late diastolic peak A.b,Ratio of early diastolic annular e′velocity and late diastolic annular a′velocity.c,Ration of early diastolic blood flow peak E velocity to early diastolic annular e’velocity.Figure 5 Blood flow and tissue Doppler spectrum of mitral valve

表4 二尖瓣的血流多普勒測量值(±s,n=6)Table 4 Measurement of blood Doppler of mitral valve(±s,n=6)

表4 二尖瓣的血流多普勒測量值(±s,n=6)Table 4 Measurement of blood Doppler of mitral valve(±s,n=6)

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表5 二尖瓣的組織多普勒測量值(±s,n=6)Table 5 Measurement of tissue Doppler of mitral valve(±s,n=6)

表5 二尖瓣的組織多普勒測量值(±s,n=6)Table 5 Measurement of tissue Doppler of mitral valve(±s,n=6)

組別Groups a′峰值速度(mm/s)Peak a′velocity,a′(mm/s)e′峰值速度(mm/s)Peak e′velocity,e′(mm/s)e′和a′比值Ratio of e′to a′,e′/a′E和e′比值Ratio of E to e′,E/e′0周0 week 25.09±2.26 28.74±3.24 1.15±0.13 23.64±3.02 2周2 weeks 19.26±2.71? 15.31±1.80? 0.80±0.09? 32.74±5.72?4周4 weeks 20.91±1.97? 15.28±2.11? 0.73±0.09? 39.03±7.53?8周8 weeks 14.31±1.63?#& 11.61±1.38?#& 0.81±0.04? 59.35±10.37?#&

2.4 小鼠心衰病理進程中左室病理組織學改變

對0、2、4、8周組小鼠進行心臟病理切片分析(圖6)。低倍鏡下顯示造模前心臟形態(tài)正常,造模2周心肌增厚、心腔減小,造模4周心臟內(nèi)徑增大,8周心腔持續(xù)性擴張(圖6A,a-d),與B型及M型超聲顯示的結(jié)果一致。高倍鏡下顯示造模前心肌細胞結(jié)構(gòu)完整、細胞排列整齊(圖6A,e);造模2周細胞增大,但仍能看到完整細胞結(jié)構(gòu)(圖6A,f);造模4周時,心肌細胞肥大、細胞結(jié)構(gòu)排列紊亂(圖6A,g);造模8周后,心臟細胞核固縮、細胞溶解、細胞間隙明顯增大(圖6A,h)。同時,天狼猩紅染色顯示,心肌組織纖維化隨著小鼠心衰進程逐步增加(圖6B,6C)。

圖6 心臟組織病理評價(n=8)Figure 6 Pathological evaluation of cardiac tissue(n=8)

3 討論

在本研究中,我們應(yīng)用影像學多種超聲模式和病理學技術(shù),展示了小鼠TAC模型的病理進程代償性心肌肥厚、過渡期到失代償擴張型心衰等三個主要階段的特征。研究結(jié)果多方位可視化的展示了壓力超負荷至心衰疾病中心臟功能逐步加劇惡化的過程,并通過HE染色觀察組織病理改變和天狼猩紅染色觀察心肌纖維化,顯示心肌組織經(jīng)歷從肥大到壞死階段,心肌膠原纖維含量從少到多的積累過程,與現(xiàn)有研究報道結(jié)果相類似[16]。這些實驗數(shù)據(jù)綜合性地評價了心衰疾病過程中心臟的改變,為此模型在心血管疾病領(lǐng)域研究的應(yīng)用提供了可靠的理論依據(jù)。

目前,已有研究人員開始關(guān)注壓力超負荷心衰小鼠模型引起的疾病變化[16-17],但評價指標較少,往往只能集中在疾病發(fā)展過程中的某個時間點[18-19]。我們對左室壓力超負荷誘發(fā)心衰的從代償性心肌肥厚、過渡期和失代償擴張型心衰三個進程的結(jié)構(gòu)和功能特點進行的分析。在影像學功能特征分析方面,我們在造模2周發(fā)現(xiàn)心臟射血分數(shù)和短軸縮短率顯著性上升,到4周后下降至正常水平,并且至第8周失代償性擴張期,射血分數(shù)和短軸短縮率持續(xù)下降。此外,我們發(fā)現(xiàn)造模八周后心臟等容收縮期顯著性延長。等容收縮時間是反映收縮能力的重要指標,結(jié)合在M-型超聲結(jié)果發(fā)現(xiàn)的小鼠收縮功能顯著受損(EF值顯著降低),我們判定心衰期左室收縮功能不足導(dǎo)致了血液不能快速沖開主動脈瓣流出左室,表現(xiàn)為等容收縮時間延長。綜上結(jié)果表明,心臟收縮功能在壓力超負荷誘發(fā)心衰的疾病進程中呈現(xiàn)先增強后持續(xù)性下降的倒“V”形變化趨勢。我們的研究結(jié)果支持了臨床上認為預(yù)防心衰需要盡早干預(yù)心臟收縮功能障礙的策略[20],為科學探索心衰發(fā)生發(fā)展機制和防治藥物研發(fā)提供參考依據(jù)。

有研究表明舒張功能的異常也是導(dǎo)致心臟疾病發(fā)展的重要因素[21-22],但是當前壓力超負荷致心衰模型的評價常集中在心臟結(jié)構(gòu)和心臟收縮功能方面,缺乏心臟舒張功能的多方面評價。目前關(guān)于心臟舒張功能評價時常使用二尖瓣血流多普勒作為單一評價方式,通過核心指標二尖瓣血流E/A比值作為主要參考依據(jù),這樣容易造成診斷誤差。研究證實,舒張期二尖瓣環(huán)的心肌運動和二尖瓣血流多普勒頻譜相互呼應(yīng),代表舒張早期瓣環(huán)運動速度e′和舒張晚期瓣環(huán)運動速度a′可作為舒張期心肌運用的直接指標,具有更高的敏感性和特異性[23]。因此,我們除了關(guān)注二尖瓣血流核心指標E/A值外,還選擇二尖瓣環(huán)組織多普勒e′/a′比值以及二者結(jié)合參數(shù)E/e′作為重要參考指標進行評價依據(jù),從而能夠多方面完整評價心臟舒張功能。

第2周舒張功能評價顯示E/A顯著下降,e′/a′和E/e′的改變顯示舒張功能受損,第4周時發(fā)現(xiàn)E/A上升至接近正常值,但e′/a′和E/e′顯示舒張功能受損,當疾病持續(xù)至第8周,E/A顯著性上升e′/a′和E/e′的顯著性改變均一致提示心臟舒張功能受損的進一步加劇,測量值表明e′/a′和E/e′與M型超聲和病理組織檢測結(jié)果完全一致。另外,我們結(jié)合e′/a′和E/e′的變化也揭示心臟舒張功能的假性正常化,與臨床上的舒張不全導(dǎo)致的假性正?；卣饕恢耓24]。因此,二尖瓣環(huán)的各項指標在舒張功能評價中必不可少。

綜上所述,通過影像學和病理學展示壓力超負荷的心衰模型經(jīng)歷了代償性心肌肥厚,過渡期到失代償擴張型心衰的疾病進程中各項功能結(jié)構(gòu)的改變,為日后小鼠主動脈弓縮窄模型的使用提供理論基礎(chǔ)。