孟雪丹 趙崇軍 趙霞 張文婷 王昭懿 顧念念 馮丹 吳怡青 鄒迪新 林瑞超

不育不孕在全球的患病率約為9%[1-2]，少精癥是男性不育的主要臨床表型，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜(基因突變、環(huán)境污染、性激素內(nèi)分泌紊亂等)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無有效的藥物治療方案[3]。

五子衍宗丸是中醫(yī)治療少弱精癥的經(jīng)典名方，由五味子、枸杞子、覆盆子、菟絲子、車前子組成，臨床上對(duì)于少精子癥治療效果顯著[4]。大量臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究不斷拓展了對(duì)五子衍宗丸藥理性質(zhì)的認(rèn)識(shí)，但多數(shù)評(píng)價(jià)仍停留在某個(gè)或某幾個(gè)角度或水平進(jìn)行研究，缺乏五子衍宗丸作用機(jī)制的系統(tǒng)研究，限制了該方的進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用[5]。白消安可造成睪丸生精細(xì)胞的損傷，是誘導(dǎo)少精癥動(dòng)物模型的常見方法[6]。為了從整體上探討五子衍宗丸治療少精癥的分子機(jī)制，本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)，分析經(jīng)五子衍宗丸治療后的少精癥小鼠睪丸組織基因表達(dá)譜的變化，應(yīng)用生物信息學(xué)從藥物調(diào)控基因的功能、信號(hào)通路等方面，為全面系統(tǒng)地探討五子衍宗丸治療少精癥的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

Balb/c雄性小鼠，(20±2)g，10周齡，SPF級(jí)，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(中國(guó)，北京)[許可證號(hào)：SCXK(京) 2018-0010]。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中，溫度為 ( 25±1) °C，相對(duì)濕度為50%～60%，自由飲水及進(jìn)食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與操作遵照北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行。將36只Balb/c小鼠隨機(jī)分成少精癥組、五子衍宗丸治療組和正常對(duì)照組，共3組，每組各12只。少精癥組給藥方法：小鼠腹腔注射白消安的DMSO溶液(1 mg/mL)，給藥劑量為20 mg/kg，建造白消安致小鼠少精癥模型。小鼠自白消安腹腔注射第2天，口服灌胃生理鹽水(14 mL/kg/d)，每日1次，連續(xù)14天。五子衍宗丸治療組給藥方法：小鼠自白消安腹腔注射第2天，口服灌胃給予五子衍宗丸 (1.56 g/kg/d)，每日1次，連續(xù)14天。正常對(duì)照組給藥方法：小鼠腹腔注射DMSO(1 mL/kg)，作為正常對(duì)照組。小鼠自DMSO腔注射第2天，口服灌胃給予生理鹽水溶液(14 mL/kg/d)，每日1次，連續(xù)14天。

1.2 藥物與試劑

五子衍宗丸：枸杞子、五味子、覆盆子、菟絲子、車前子購(gòu)于同仁堂藥業(yè)有限公司(中國(guó)北京)，制備標(biāo)準(zhǔn)參照2015版《中華人民共國(guó)藥典》，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)中心(北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)制備成大蜜丸，4°C保存?zhèn)溆谩０紫操?gòu)于麥克林生物化學(xué)公司 (中國(guó)上海)，二甲基亞砜( DMSO)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司 (中國(guó)北京) ，牛血清白蛋白購(gòu)自索萊寶公司(中國(guó)北京)，胎牛血清( BI) 、DMED/F12 培養(yǎng)基購(gòu)于Sigma 公司(美國(guó)密蘇里州)，70 μm細(xì)胞篩購(gòu)于Corning公司(美國(guó)紐約州)，Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司(美國(guó)加利福尼亞州)，QIAGEN RNeasy Mini Kit購(gòu)于Qiagen公司(德國(guó)杜塞爾多夫)，GeneChip WT PLUS Kit、GeneChip IVT Labeling Kit、Affymetrix Mouse Clariom?S Array購(gòu)于Affymetrix公司(美國(guó)加利福尼亞州)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

CIOC-XSI-G型生物顯微鏡(重慶光電儀器有限公司，中國(guó))；BP-D精密電子天平(北京賽多利斯天平有限公司，中國(guó))；RJ-TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)(無錫市瑞江分析儀器有限公司，中國(guó))；FACSCalibur單激光流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))；Thremo Nanodrop 2000(Thermo公司，美國(guó))；Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent公司，美國(guó))，Affymetrix Fluidics Station 450(Agilent公司，美國(guó))，GeneChip Scanner 3000(Agilent公司，美國(guó))。

1.4 小鼠睪丸病理分析

末次給藥24小時(shí)后，稱取小鼠體重，乙醚麻醉，剖開腹腔取出睪丸，頸椎脫臼法處死小鼠。取右側(cè)睪丸置于體積分?jǐn)?shù)4%的甲醛溶液中固定后，制成HE染色石蠟切片，顯微鏡下觀察并分析記錄組織形態(tài)。

1.5 睪丸單細(xì)胞懸液的制備

左側(cè)睪丸置于1%雙抗的PBS中清洗，手術(shù)剪刀剪開睪丸白膜，暴露生精小管，移生精小管入含I型膠原酶(120 U/mL)的PBS中，于32℃水浴搖床上，溫和震搖5分鐘。隨后加入適量0.25%Trypsin和DNaseI，至DNaseI 終濃度為300 μg/mL，消化5～7分鐘后，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，用PBS預(yù)潤(rùn)的細(xì)胞篩(70 μm)過濾去除未消化的組織，將濾液移入離心管中，4℃，500×g，離心5分鐘，棄上清，重懸細(xì)胞，吹打混勻，制成睪丸單細(xì)胞懸液(濃度≥106個(gè)細(xì)胞/mL)。

1.6 睪丸中不同倍體精子細(xì)胞比例測(cè)定

取上述正常對(duì)照組、少精癥組和五子衍宗丸治療組的睪丸單細(xì)胞懸液樣品，每組6份，置冰上避光暫存，進(jìn)行流式細(xì)胞測(cè)定。應(yīng)用Cell Quest軟件，根據(jù)DNA 含量確定單倍體(精子細(xì)胞)、二倍體(G1期精原細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞)和四倍體(G2期精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞)的細(xì)胞群比例。

1.7 睪丸細(xì)胞的基因芯片檢測(cè)

取正常對(duì)照組、少精癥組和五子衍宗丸治療組的睪丸單細(xì)胞懸液樣品，每組6份，提取各組的總RNA，經(jīng)純化、雜交等過程處理后，應(yīng)用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)強(qiáng)度的檢測(cè)，獲得各基因的表達(dá)強(qiáng)度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將處理后的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Significance Analysis of Microarrays (SAM) 軟件，計(jì)算兩兩實(shí)驗(yàn)組間的基因表達(dá)值的變化倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)和顯著性差異值(P-value)。以|FC|>1.5且P-value<0.05為標(biāo)準(zhǔn)條件，篩選組間差異基因。將篩選出的差異基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(https：//David.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO功能分析、KEGG信號(hào)通路分析。采用SPSS 20.0軟件對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式，經(jīng)正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示檢驗(yàn)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且方差齊。對(duì)空白對(duì)照組、少精癥組和五子衍宗丸治療組使用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 睪丸組織病理分析

與正常對(duì)照組相比，少精癥組小鼠睪丸組織病理切片出現(xiàn)明顯的少精癥的睪丸損傷病理改變，如生精小管萎縮、生精小管上皮變薄、管腔內(nèi)生精細(xì)胞層級(jí)減少，排列紊亂，生精細(xì)胞間隙變寬，生精細(xì)胞發(fā)育阻滯在精母細(xì)胞階段。與少精癥組相比，五子衍宗丸治療組小鼠睪丸組織病理切片的生精小管排列整齊，結(jié)構(gòu)完整；管腔內(nèi)生精細(xì)胞排列緊密、層次清晰。見圖1。

2.2 睪丸精子細(xì)胞比例

與正常對(duì)照組相比，少精癥組的睪丸精子細(xì)胞比例顯著下降，與文獻(xiàn)報(bào)道的少精癥睪丸精子細(xì)胞比例相近[7]。與少精癥組相比，五子衍宗丸治療組的睪丸精子細(xì)胞比例顯著增加。見圖2和表1。

表1 正常對(duì)照組、少精癥組、五子衍宗丸治療組小鼠睪丸組織精子細(xì)胞比例比較(n=6)

注：A1、A2為正常對(duì)照組；B1、B2為少精癥組；C1、C2為五子衍宗丸治療組。

2.3 睪丸基因表達(dá)譜分析

2.3.1 差異基因篩選 應(yīng)用SAM 軟件對(duì)基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異基因的篩選，結(jié)果顯示，五子衍宗丸治療組與少精癥組相比，五子衍宗丸治療組共有839個(gè)差異表達(dá)基因，其中426個(gè)基因上調(diào)(差異基因集1)，613個(gè)基因下調(diào)(差異基因集2)，見圖3A；正常對(duì)照組與少精癥組相比，正常對(duì)照組共有1791個(gè)差異表達(dá)基因，其中915 個(gè)基因上調(diào)(差異基因集3)，876個(gè)基因下調(diào)(差異基因集4)，見圖3B。為篩選與少精癥組相比，五子衍宗丸治療組和正常對(duì)照組同時(shí)上調(diào)的基因，對(duì)差異基因集1和差異基因集3作交集(五子衍宗丸上調(diào)的差異基因)，結(jié)果表明五子衍宗丸上調(diào)的差異基因共有55個(gè)。見圖4A。進(jìn)一步篩選與少精癥組相比，五子衍宗丸治療組和正常對(duì)照組同時(shí)下調(diào)的基因，對(duì)差異基因集2和差異基因集5作交集(五子衍宗丸下調(diào)的差異基因)，結(jié)果顯示，五子衍宗丸下調(diào)的差異基因有542個(gè)，見圖4B。

注：A為正常對(duì)照組；B為少精癥組；C為五子衍宗丸治療組；圖中 “1C”表示睪丸組織中的精子細(xì)胞(DNA含量為單倍體的細(xì)胞)；“2C”表示睪丸組織中的G1期精原細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞(DNA含量為二倍體的細(xì)胞)；“4C”表示睪丸組織中的G2期精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞(DNA含量為四倍體的細(xì)胞)。

注：A 為五子衍宗丸治療組與少精癥組之間的差異表達(dá)基因火山圖； B 為正常對(duì)照組與少精癥組之間的差異表達(dá)基因火山圖；圖中藍(lán)色代表下調(diào)基因；紅色代表上調(diào)基因；灰色代表無顯著表達(dá)變化基因。

注：A為五子衍宗丸組與少精癥組相比上調(diào)的基因及正常對(duì)照組與少精癥組相比上調(diào)的基因，交集部分為五子衍宗丸治療組和正常對(duì)照組共同上調(diào)的基因；B為五子衍宗丸組與少精癥組相比下調(diào)的基因和正常對(duì)照組與少精癥組相比下調(diào)的基因，交集部分為五子衍宗丸治療組和正常對(duì)照組共同下調(diào)的基因。

2.3.2 GO功能分析 對(duì)五子衍宗丸上調(diào)的差異基因進(jìn)行GO生物過程分析，結(jié)果顯示，藥物上調(diào)基因共顯著富集到68條GO條目(P<0.05)，以P值對(duì)其進(jìn)行顯著性差異的排序，上調(diào)排名前10名的GO條目見圖5A和表2，其中與調(diào)節(jié)男性生殖有直接聯(lián)系的GO條目為對(duì)精子生成的調(diào)控、對(duì)生精細(xì)胞減數(shù)分裂周期的調(diào)控、對(duì)精子細(xì)胞分化的調(diào)控、對(duì)生精細(xì)胞減數(shù)分裂過程中非姐妹染色單體交叉點(diǎn)形成的調(diào)節(jié)、對(duì)生精細(xì)胞減數(shù)分裂過程中聯(lián)會(huì)復(fù)合體形成的調(diào)節(jié)、對(duì)生精細(xì)胞減數(shù)分裂中的同源染色體配對(duì)的調(diào)控。五子衍宗丸下調(diào)的差異基因進(jìn)行GO生物過程分析后，顯著富集到1042條GO條目(P<0.05)，按照P值排序，下調(diào)排名前10名的GO條目見圖5B和表2，涉及氧化還原過程、酶原活化、脂質(zhì)代謝過程、 全身動(dòng)脈血壓的調(diào)節(jié)、 脂肪酸代謝過程 、 甾體生物合成過程、 對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的響應(yīng)、老化、免疫系統(tǒng)過程和谷胱甘肽代謝過程。

2.3.3 信號(hào)通路分析 對(duì)五子衍宗丸上調(diào)的差異基因進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路分析，結(jié)果顯示，藥物上調(diào)基因顯著富集到3條信號(hào)通路(P<0.05)，見圖6A和表3，包括同源重組通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路和蛋白質(zhì)輸出通路，這三條通路均與生命體的遺傳信息處理密切相關(guān)。對(duì)五子衍宗丸下調(diào)的差異基因進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路分析后，共顯著富集到53條信號(hào)通路(P<0.05)，以P值對(duì)其進(jìn)行顯著性差異的排序，下調(diào)排名前10名的信號(hào)通路見圖6B和表3，主要涉及腎素-血管緊張素系統(tǒng)、膽固醇代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450通路、 脂肪酸代謝、內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)的鈣再吸收等信號(hào)通路。

注：A為五子衍宗丸上調(diào)的差異基因(55個(gè))高度富集的前10條GO生物過程條目；B為五子衍宗丸下調(diào)的差異基因(542個(gè))高度富集的前10條GO生物過程條目

表2 五子衍宗丸調(diào)控睪丸差異基因高度富集的GO生物過程條目注釋

注：A為五子衍宗丸上調(diào)的差異基因(55個(gè))顯著富集的KEGG信號(hào)通路； B為五子衍宗丸下調(diào)的差異基因(542)高度富集的前10條KEGG信號(hào)通路。

表3 五子衍宗丸調(diào)控睪丸差異基因高度富集的KEGG信號(hào)通路注釋

3 討論

本研究以白消安致少精癥小鼠為陰性對(duì)照，以五子衍宗丸口服給藥為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，以正常動(dòng)物為空白對(duì)照，從睪丸病理和睪丸精子細(xì)胞比例兩個(gè)方面考察了五子衍宗丸口服給藥治療少精癥的效應(yīng)，研究結(jié)果顯示五子衍宗丸能明顯修復(fù)少精癥小鼠睪丸組織病理損傷，提高睪丸組織內(nèi)精子細(xì)胞比例，治療實(shí)驗(yàn)性少精癥療效顯著。在此基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步探討五子衍宗丸治療少精癥的分子機(jī)制，應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析了睪丸組織基因表達(dá)譜，系統(tǒng)地篩選出五子衍宗丸調(diào)控的少精癥小鼠睪丸基因有597個(gè)，其中55個(gè)上調(diào)，542個(gè)下調(diào)。五子衍宗丸調(diào)控的睪丸基因主要參與的GO 條目有精子生成、生精細(xì)胞減數(shù)分裂的周期、精子細(xì)胞分化、生精細(xì)胞減數(shù)分裂中的同源染色體配對(duì)、聯(lián)會(huì)復(fù)合體形成、非姐妹染色單體交叉點(diǎn)形成、氧化還原過程、酶原活化、脂質(zhì)代謝等生物過程；參與的信號(hào)通路主要有同源重組、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、蛋白質(zhì)輸出、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、膽固醇代謝、細(xì)胞色素P450對(duì)藥物的代謝等。

五子衍宗丸治療后，少精癥小鼠睪丸組織中調(diào)控精子生成的基因Rnf17、Trip13、Sohlh2 等表達(dá)上調(diào)，Rnf17在睪丸組織中特異性表達(dá)，是編碼精子生成的關(guān)鍵調(diào)控因子，該基因突變可導(dǎo)致雄性成年小鼠不育[8]。Trip13基因的表達(dá)可調(diào)節(jié)精母細(xì)胞減數(shù)分裂重組和DNA雙鏈斷裂修復(fù)，Trip13突變無法完成小鼠精母細(xì)胞的減數(shù)分裂重組，出現(xiàn)重組缺陷，觸發(fā)精母細(xì)胞階段阻滯，精子生成停滯[9-10]。Sohlh2是精子生成的特異性轉(zhuǎn)錄因子，僅在減數(shù)分裂前的精原細(xì)胞中表達(dá)，可通過調(diào)節(jié)A型精原細(xì)胞分化為B型精原細(xì)胞，影響分化精原細(xì)胞的活力，缺少Sohlh2的雄性小鼠由于精子生成的早期阻滯而無法生育[11]。Sycp1是編碼減數(shù)分裂橫絲蛋白的基因，調(diào)節(jié)精母細(xì)胞減數(shù)分裂重組、突觸復(fù)合體組裝和XY染色體形成，是維持男性生育力所必需的基因，Sycp1突變小鼠的精母細(xì)胞不形成XY染色體，且不能完成減數(shù)分裂重組的修復(fù)，觸發(fā)精子生成的中斷[12]。Gasz是僅在生殖細(xì)胞中表達(dá)的進(jìn)化保守基因，編碼具有四個(gè)錨蛋白重復(fù)序列，不育α基序和亮氨酸拉鏈的蛋白，可抑制雄性生殖細(xì)胞中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達(dá)，并影響雄性生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂，Gasz功能的喪失會(huì)導(dǎo)致男性不育，并具有成核和piRNA生物合成方面的缺陷[13]。另外，Gasz可與生殖細(xì)胞關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑Dazl相互作用，以協(xié)同方式促進(jìn)胚胎干細(xì)胞衍生的生殖細(xì)胞，Gasz缺乏導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞分化過程中生殖細(xì)胞明顯減少[14]。由上可知，五子衍宗丸可調(diào)節(jié)少精癥小鼠睪丸精子生成過程中多個(gè)基因的表達(dá)，提示這些基因的改變可能與該方有效治療少精癥的分子機(jī)制高度關(guān)聯(lián)。

同源重組(homologous recombination，HR)信號(hào)通路不僅在生精細(xì)胞減數(shù)分裂的同源染色體配對(duì)、聯(lián)會(huì)、交換等具有重要的調(diào)節(jié)作用，而且參與修復(fù)DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂和鏈間交聯(lián)等損傷，該通路抑制后，會(huì)導(dǎo)致生精細(xì)胞的減數(shù)分裂受阻，造成雄性不育缺陷[15]。本研究中，五子衍宗丸顯著上調(diào)了少精癥小鼠睪丸組織中的HR信號(hào)通路，提示藥物修復(fù)的HR信號(hào)通路可能與五子衍宗丸對(duì)少精癥小鼠睪丸精子生成的調(diào)節(jié)作用高度關(guān)聯(lián)。五子衍宗丸顯著下調(diào)少精癥小鼠睪丸組織中的信號(hào)通路主要有腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin-system，RAS)和膽固醇代謝。在男性生殖系統(tǒng)中，RAS信號(hào)通路的成分在睪丸Leydig細(xì)胞、附睪上皮細(xì)胞、附睪脂肪墊和前列腺腺上皮中表達(dá)，以旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌方式參與精子成熟，精漿維持電解質(zhì)和睪丸類固醇生成[16]，有研究表明抑制該信號(hào)通路有助于睪丸類固醇(睪丸酮、雌二醇和促黃體生成素)的生成，進(jìn)而影響睪丸生精功能[17]，提示五子衍宗丸下調(diào)少精癥小鼠睪丸組織中的RAS信號(hào)通路可能影響了睪丸類固醇的生成。膽固醇穩(wěn)態(tài)與男性生育力密切相關(guān)，一方面膽固醇是睪丸雄激素的合成前體，另一方面其是生殖細(xì)胞細(xì)胞膜的主要成分，對(duì)膜的流動(dòng)性、離子通道功能和信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活具有重要的調(diào)節(jié)作用[18]，有文獻(xiàn)報(bào)道睪丸組織生精障礙會(huì)引起膽固醇代謝異常，可能直接影響生殖細(xì)胞的膽固醇穩(wěn)態(tài)[19]。 本研究中，少精癥小鼠睪丸組織的膽固醇代謝途徑異常上調(diào)，五子衍宗丸治療后下調(diào)了該信號(hào)通路，提示五子衍宗丸可能通過干預(yù)膽固醇代謝途徑，維持生殖細(xì)胞的膽固醇穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮藥物效應(yīng)。

本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)系統(tǒng)分析了五子衍宗丸對(duì)少精癥小鼠睪丸組織基因表達(dá)譜的影響，從基因?qū)用姹碚髁宋遄友茏谕柚委熒倬Y的分子機(jī)制。結(jié)果顯示，少精癥小鼠經(jīng)五子衍宗丸治療后睪丸組織中與精子生成相關(guān)的多個(gè)基因和多條信號(hào)通路發(fā)生了顯著變化，通過生物信息學(xué)挖掘，發(fā)現(xiàn)五子衍宗丸主要是通過調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的減數(shù)分裂、睪丸HR信號(hào)通路、睪丸RAS信號(hào)通路、睪丸膽固醇代謝等影響精子生成及睪丸生精功能，從而對(duì)少精癥起到治療作用，同時(shí)，為闡明五子衍宗丸治療少精癥的藥理作用機(jī)制、進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供了一定的參考。