武秋紅 孔靜 黃玉娟 范圓圓 李思潼 劉路路 高園園 陳思玉 孫仁弟 黃廣偉 姜艷艷 石任兵

丁香，始載于《藥性本草》，是桃金娘科植物丁香EugeniacaryophyllataThunb.的干燥花蕾，屬于“藥食同源物品”之一，其性溫，味辛，歸脾、胃、腎經(jīng)，具有溫中止痛、降逆的作用，用于治療脾胃虛寒、呃逆嘔吐、食少吐瀉、心腹冷痛和腎虛陽(yáng)痿[1]。

文獻(xiàn)表明，丁香主要含有黃酮類、苯丙素類、酚酸類、三萜類等化學(xué)成分[2]。有文獻(xiàn)分別報(bào)道對(duì)丁香中的苯丙素類成分丁香酚，黃酮類成分蘆丁、槲皮素，三萜類成分齊墩果酸、熊果酸、山楂酸、科羅索酸、白樺脂酸進(jìn)行含量進(jìn)行測(cè)定[3-5]，對(duì)酚類成分丁香酚、阿魏酸、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量測(cè)定及指紋圖譜研究[6]；2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》以丁香酚的含量作為丁香飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)[7]。

筆者在對(duì)理氣類藥食同源藥味質(zhì)量表征研究中，發(fā)現(xiàn)丁香具有確切的促胃動(dòng)力功效作用(左旋精氨酸所致大鼠胃動(dòng)力障礙模型下，大鼠胃殘留率、血漿胃動(dòng)素，給藥組與模型組比較P<0.01)。本文報(bào)道在本課題組前期建立的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式基礎(chǔ)上[8-16]，進(jìn)一步研究建立有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征模式、方法與質(zhì)量評(píng)價(jià)。即以確定有促胃動(dòng)力作用的丁香飲片作為飲片基準(zhǔn)，以具有促胃動(dòng)力功效的代表性成分及其含量作為質(zhì)量表征基準(zhǔn)點(diǎn)，采用HPLC-PDA(高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器；High Performance Liquid Chromatography-Photo-diode Array)建立丁香有效基準(zhǔn)特征圖譜，涵蓋其提取物促胃動(dòng)力藥物體系之藥學(xué)架構(gòu)主要化學(xué)類型：酚酸類、黃酮類、苯丙素類、三萜類；基于對(duì)照品模擬基準(zhǔn)點(diǎn)的有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征信息作為評(píng)價(jià)丁香飲片的質(zhì)量標(biāo)尺，并對(duì)其準(zhǔn)確性進(jìn)行佐證及質(zhì)量評(píng)價(jià)應(yīng)用與驗(yàn)證。以精準(zhǔn)、有效、簡(jiǎn)易地評(píng)價(jià)丁香飲片的質(zhì)量，為丁香的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也為有關(guān)藥物的質(zhì)量有效評(píng)價(jià)與控制提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695自動(dòng)進(jìn)樣高效液相色譜儀，2998PDA檢測(cè)器，Empower工作站；XS205型1/100000電子分析天平和AL204型1/10000電子分析天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；Serial型數(shù)控超聲波清洗器(北京市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥與試劑

沒食子酸對(duì)照品(批號(hào)：110831-201204，純度≥98%)、異槲皮苷對(duì)照品(批號(hào)：P25J9F65872，純度≥98%)、丁香酚對(duì)照品(批號(hào)：Z03D5Y7，純度≥98%)、山楂酸對(duì)照品(批號(hào)：Z24F9B54635，純度≥98%)、齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)：HA0820KA14，純度≥98%)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；色譜級(jí)乙腈，購(gòu)自Fisher Scientific公司；純凈水，購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；分析甲醇。從各藥店購(gòu)得的15批丁香飲片，其中S10為前期藥效實(shí)驗(yàn)中確定有促胃動(dòng)力作用的丁香飲片(飲片基準(zhǔn))，由北京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定系劉春生教授鑒定，所購(gòu)丁香飲片都是正品飲片，丁香飲片的采購(gòu)地點(diǎn)、產(chǎn)地、批號(hào)見表1，留樣飲片存儲(chǔ)于北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)校區(qū)中藥化學(xué)系。

表1 15批丁香飲片的產(chǎn)地、批號(hào)及采購(gòu)地點(diǎn)

2 方法與結(jié)果

2.1 有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征方法的建立

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品3.93 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得沒食子酸對(duì)照品溶液(a)；精密稱取異槲皮苷對(duì)照品2.95 mg，置20 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得異槲皮苷對(duì)照品溶液(b)；精密稱取丁香酚對(duì)照品21.67 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得丁香酚對(duì)照品溶液(c)；精密稱取山楂酸對(duì)照品3.91 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得山楂酸對(duì)照品溶液(d)；精密稱取齊墩果酸對(duì)照品5.92 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得齊墩果酸對(duì)照品溶液(e)；分別精密量取a、b、c、d、e對(duì)照品溶液各1.0 mL、0.5 mL、5.0 mL、1.0 mL、1.0 mL置同一10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得含沒食子酸、異槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齊墩果酸濃度分別為：39.300 μg/mL、7.375 μg/mL、1.0835 mg/mL、39.100 μg/mL、59.200 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取過二號(hào)篩的丁香飲片基準(zhǔn)(S10)粉末及待評(píng)價(jià)飲片粉末約0.25 g，精密稱定，置于100 mL具塞的錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定其重量，加熱回流提取2次，每次1小時(shí)，冷卻至室溫，再稱定其重量，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，用少量80%甲醇分次洗滌容器和殘?jiān)?，濾過，將濾液與洗滌液合并于100 mL圓底燒瓶中，50℃減壓濃縮，并完全轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶，冷卻至室溫，80%甲醇定容至刻度線，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜檢測(cè)條件 XBridge Shield RP18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-2%磷酸水溶液，梯度洗脫(0～10分鐘，5%～6%A；10～30分鐘，6%～22%A；30～50分鐘，22%～23%A；50～70分鐘，23%～47%A；70～75分鐘，47%～75%A；75～100分鐘，75%A)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm，進(jìn)樣量20 μL，采集時(shí)間：100分鐘。

丁香飲片(S10)樣品、混合對(duì)照品在以上色譜檢測(cè)條件下的HPLC色譜圖，見圖1。

14個(gè)色譜峰在圖譜中顯示分離度良好，通過與沒食子酸、異槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齊墩果酸對(duì)照品紫外吸收光譜對(duì)比，判斷14個(gè)特征峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分類型，涵蓋了丁香酚酸類、黃酮類、苯丙素類、三萜類4種主要化學(xué)成分類型。

注：A供試品；B混合對(duì)照品；1沒食子酸；2異槲皮苷；3丁香酚；4山楂酸；5齊墩果酸；6、7酚酸類成分；8、9、10、11、12、13黃酮類成分；14苯丙素類成分。

2.1.4 有效基準(zhǔn)特征圖譜方法學(xué)考察 (1)精密度考察：按2.1.2項(xiàng)下制備丁香飲片(S10)供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，以丁香酚為參照，計(jì)算各色譜峰與參比峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果顯示：相對(duì)峰面積的RSD均小于1.32%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.26%，表明儀器精密度良好，符合特征圖譜要求(RSD≤3%)[17]。(2)穩(wěn)定性考察：按2.1.2項(xiàng)下制備丁香飲片(S10)供試品溶液，室溫放置，于制備后0、2、4、6、8、12、24小時(shí)，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以丁香酚為參照，計(jì)算各色譜峰與參比峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果顯示：相對(duì)峰面積的RSD均小于1.42%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.56%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定(RSD≤3%)[17]。(3)重復(fù)性考察：取丁香飲片(S10)，按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備丁香飲片(S10)供試品溶液6份，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以丁香酚為參照，計(jì)算各色譜峰與參比峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果顯示：相對(duì)峰面積的RSD均小于2.12%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.82%，表明本方法重復(fù)性良好(RSD≤3%)[17]。

2.1.5 代表性成分含量測(cè)定方法學(xué)考察 (1)線性關(guān)系考察：按2.1.1項(xiàng)下制備混合對(duì)照品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件分別進(jìn)樣2、 5、 10、 15、 20、 25、 30 μL，測(cè)定代表性成分峰面積，以對(duì)照品的量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，線性方程相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，表明線性范圍符合測(cè)定要求(r≥0.99)[17]。見表2。(2)精密度考察：按2.1.2項(xiàng)下制備丁香飲片(S10)供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，計(jì)算沒食子酸、異槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齊墩果酸峰面積的RSD均小于2.63%，表明儀器精密度良好，符合含量測(cè)定要求(RSD≤3%)[17]。(3)穩(wěn)定性考察：按2.1.2項(xiàng)下制備丁香飲片(S10)供試品溶液，室溫放置，于制備后0、2、4、6、8、12、24小時(shí)，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算沒食子酸、異槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齊墩果酸峰面積的RSD均小于2.25%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD≤3%)[17]。(4)重復(fù)性考察：取丁香飲片(S10)，按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備丁香飲片(S10)供試品溶液6份，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明本飲片樣品中沒食子酸、異槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齊墩果酸的平均含量分別為0.4175%、0.0610%、15.7583%、0.3186%、0.5795%，RSD分別為1.21%、2.88%、1.46%、2.28%、1.90%，表明本方法重復(fù)性良好(RSD≤3%)[17]。(5)加樣回收率考察：精密稱取沒食子酸對(duì)照品5.21 mg、丁香酚對(duì)照品196.86 mg、山楂酸對(duì)照品4.83 mg、齊墩果酸對(duì)照品7.30 mg置同一10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液(f)；精密稱取異槲皮苷對(duì)照品2.84 mg置20 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得異槲皮苷對(duì)照品溶液；取已知特征代表性成分含量的過二號(hào)篩的丁香飲片(S10)粉末6份，約0.125 g，精密稱定，分別置于6個(gè)100 mL具塞錐形瓶中，同時(shí)精密量取混合對(duì)照品溶液(f)1.0 mL、異槲皮苷對(duì)照品溶液0.5 mL置以上6個(gè)100 mL具塞錐形瓶中，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算沒食子酸、異槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齊墩果酸的平均加樣回收率分別為100.33%、97.90%、100.12%、96.89%、101.45%，RSD分別為2.20%、1.92%、1.84%、2.82%、1.83%，表明本方法準(zhǔn)確可靠(回收率在95%～102%之間，RSD≤3%)[17]。見表3。

2.1.6 模擬基準(zhǔn)點(diǎn)質(zhì)量表征考察 文獻(xiàn)報(bào)道丁香酚具有促胃動(dòng)力作用[1]，因此以丁香酚作為質(zhì)量表征基準(zhǔn)點(diǎn)。精密稱取丁香酚對(duì)照品7.87 mg，至5 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.574 mg/mL的丁香酚對(duì)照品溶液作為模擬基準(zhǔn)點(diǎn)，與2.1.2項(xiàng)下制備的丁香飲片(S10)供試品溶液中所檢測(cè)的丁香酚含量相同，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，得模擬基準(zhǔn)點(diǎn)的HPLC色譜圖，見圖2。

表3 加樣回收率考察結(jié)果(n=6)

續(xù)表

由模擬基準(zhǔn)點(diǎn)色譜圖可得丁香酚對(duì)照品的保留時(shí)間及峰面積與丁香有效基準(zhǔn)特征圖譜中丁香酚的保留時(shí)間及峰面積相吻合，表明所建立的檢測(cè)方法及其檢測(cè)結(jié)果與模擬丁香質(zhì)量表征基準(zhǔn)點(diǎn)具有準(zhǔn)確性，即丁香酚對(duì)照品溶液(1.574 mg/mL)可作為模擬表征點(diǎn)。

2.2 有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征信息

有效基準(zhǔn)特征圖譜中14個(gè)特征峰的保留時(shí)間、峰面積(以100 mg丁香飲片計(jì))、含量，以模擬基準(zhǔn)點(diǎn)為基準(zhǔn)得到的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積、相對(duì)含量，換算系數(shù)(代表性成分的相對(duì)含量/代表性成分的相對(duì)峰面積)，見表4。

表4 14個(gè)特征峰的保留時(shí)間、峰面積、含量、相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積、相對(duì)含量、換算系數(shù)

以上可得，基于模擬基準(zhǔn)點(diǎn)得到的14個(gè)特征峰及其相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，5個(gè)代表性成分的相對(duì)含量，即為丁香有效質(zhì)量基準(zhǔn)標(biāo)尺。

2.3 評(píng)價(jià)與驗(yàn)證

取14批待評(píng)價(jià)丁香飲片，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件進(jìn)樣檢測(cè)，得到的14批待評(píng)價(jià)丁香飲片質(zhì)量表征信息，同時(shí)實(shí)測(cè)丁香飲片S10(基準(zhǔn))有效基準(zhǔn)特征圖譜，以及實(shí)測(cè)14批待評(píng)價(jià)丁香飲片代表性成分含量，以驗(yàn)證基于質(zhì)量標(biāo)尺進(jìn)行丁香質(zhì)量評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。如圖3、4、5、6，以及表5所示。

如圖3、4所示，14批丁香飲片特征圖譜皆含有14個(gè)相同的特征峰，且14個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間與基準(zhǔn)標(biāo)尺基本一致，同時(shí)也與實(shí)測(cè)值相吻合。結(jié)果表明：14批皆為丁香飲片，且驗(yàn)證了應(yīng)用基準(zhǔn)標(biāo)尺辨別丁香飲片真?zhèn)蔚臏?zhǔn)確性。

圖3 14批丁香飲片與基準(zhǔn)(S10)的HPLC特征圖譜(215 nm)

圖4 14批丁香飲片與基準(zhǔn)(S10)相對(duì)保留時(shí)間

由圖5、6可見14批丁香飲片質(zhì)量表征信息，根據(jù)其特征峰相對(duì)峰面積及其相對(duì)含量高于其基準(zhǔn)標(biāo)尺對(duì)應(yīng)點(diǎn)的數(shù)目、幅度和所涵蓋的4種主要化學(xué)類型及其丁香酚同類成分，綜合考量評(píng)價(jià)得出樣品S13、S2、S9、S14、S15、S3和S7質(zhì)量較優(yōu)。

圖5 14批丁香飲片與基準(zhǔn)(S10)的相對(duì)峰面積

圖6 14批丁香飲片與基準(zhǔn)(S10)的相對(duì)含量

由表5可得，換算含量與實(shí)測(cè)含量基本一致，即驗(yàn)證了代表性成分換算含量結(jié)果的準(zhǔn)確性及其相對(duì)含量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表5 14批丁香飲片中5個(gè)特征代表性成分的含量(%；n=2)

3 討論

本研究在自然藥學(xué)觀相關(guān)理論的指導(dǎo)下[18-21]，建立了丁香有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征方法，丁香飲片中的14個(gè)特征峰覆蓋了苯丙素類、黃酮類、酚酸類、三萜類這四種化學(xué)成分類型，其中，丁香酚具有健脾胃的作用[1]、沒食子酸具有抗消化性潰瘍的作用[22]、齊墩果酸具有抗胃潰瘍的作用[23]、異槲皮苷具有對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用[24]，苯丙素類成分具有健胃的作用[1]，黃酮類、酚酸類、三萜類成分均對(duì)消化系統(tǒng)有積極作用[25-26]，從而整體反映了丁香的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)構(gòu)建了丁香質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，并對(duì)14批丁香飲片進(jìn)行了飲片質(zhì)量?jī)?yōu)良度評(píng)價(jià)，經(jīng)構(gòu)建的丁香質(zhì)量評(píng)價(jià)模式分析可知：樣品S13、S2、S9、S14、S15、S3和S7質(zhì)量較優(yōu)。建立的丁香基準(zhǔn)有效特征圖譜質(zhì)量表征模式、方法能夠整體、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)易地對(duì)丁香飲片進(jìn)行質(zhì)量表征，構(gòu)建的丁香質(zhì)量評(píng)價(jià)模式關(guān)注了丁香飲片質(zhì)量的精確性與應(yīng)用有效性，為丁香的質(zhì)量評(píng)價(jià)與篩選及其藥物質(zhì)量的精準(zhǔn)預(yù)期提供了依據(jù)。